Summary
Samenvatting onderdeel (q)PCR moleculaire detectie 2
- Course
- Institution
samenvatting onderdeel (q)PCR moleculaire detectie 2
[Show more]
Seller
Follow
ahofstra00
Content preview
SAMENVATTING ONDERDEEL qPCR1. PCR en RT-PCR
1.1 PCR
Alle PCR’s zijn gebaseerd op hetzelfde principe met dezelfde stappen:
1. Denatureren bij 95 graden
2. Hybridisatie bij 55 graden
3. Elongatie bij 72 graden
PCR-producten worden gevisualiseerd op een agarosegel
Eindpunt PCR
Eind-punt PCR:
Geen informatie over de kinetiek van de reactie
Geen informatie over de starthoeveelheid van de sjabloon
Geen informatie over de effectiviteit van de amplificatie
1.2 RT-PCR
Reverse transcriptase PCR:
Maakt van RNA cDNA
o Moet eerst naar cDNA, omdat RNA niet stabiel is
Het enzym dat gebruikt wordt is Reverse transcriptase
Verder heb je nodig
o Primers
o dNTPs
o Water
o Buffer
Daagt het oorspronkelijke centrale dogma van de moleculaire biologie uit
RNA-afhankelijke DNA-polymerasen
Wat doe je bij RT-PCR:
o Isoleer totaal RNA of mRNA
o RNA moet je controleren op kwaliteit (bv nanodrop)
o Genomisch DNA eruit halen, zodat je alleen maar RNA overhoudt
Dnase I
RT-PCR primers
Drie soorten:
o Oligo(dT) primers
Specifiek voor poly(A) staarten
Alleen eukaryote mRNA's
Verankerde oligo (dT) is gemodificeerd aan 3'end
o Random primers
Korte, random sequenties
RT-PCR of RNA zonder poly(A) staarten
o Gen-specifieke primers
Ontworpen op basis van bekende volgorde
miRNA
, 2. qPCR
2.1 basis van qPCR
qPCR:
quantitatieve PCR (of Real-time PCR)
o Gevoelig en betrouwbaar
o Kwantitatief door fluorescent signaal tijdens amplificatie
o Hoeveelheid product kan na elke cyclus worden gevisualiseerd
Resultaten
o Fluorescerend signaal elke cyclus
o Ct-waarde is evenredig met invoerbedragen
o Meer cycli
Minder DNA
Fluorescerende kleurstoffen
o DNA-bindende middelen
SYBR green
o Hydrolysesondes
Taqman-probe
qPCR gebruik je wanneer je dingen wil kwatificeren:
Kwantificering van nucleïnezuren
1 of 2 of 3 (maximaal 20?) DNA/RNA-doelen
Doel is bekend
2.2 kleurstoffen
SYBR green:
Fluorescerende kleurstof
Bindt aan dsDNA (dubbelstrengs DNA)
Straalt licht uit wanneer gebonden
Meer fluorescerend signaal duidt op meer product
Niet specifiek, kan aan al het dubbelstrengs DNA binden
Taqman:
Kleurstof en quencher (demper > geen signaal) op een ssDNA (enkelstrengs DNA)
Probe bindt aan complementair DNA-fragment
Nieuw gesysnthetiseerde stam verdringt de sonde, waardoor fluorofoor vrijkomt
Elke cyclus meer fluorescentie
3. Primer design
Voor het kiezen van primers wordt onderscheid gemaakt tussen gDNA en (mRNA/)cDNA
Exon/exon border = er zijn geen intronen aanwezig.
Primers zijn specifiek voor cDNA, omdat gDNA nog intronen bevat.
Splice varianten = extra exon verwijderd
Geeft product lengte van 80-200bp
Doel: Bepalen of de expressie van een gen omhoog of omlaag gaat
We gaan hoeveelheid transcript meten van enkele specifieke genen
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller ahofstra00. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.25. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
64438 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now