Summary
Samenvatting les 4/6 van Biotechnologie
- Course
- Institution
Samenvatting van les 4 van biotechnologie van de slides met eigen notities.
[Show more]
Seller
Follow
VDSA
Reviews received
Content preview
Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodiesRecap: van DNA naar construct
,Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies
- Kennis van de finale applicatie leidt de tussenliggende stappen
- Meerder manieren om EW te klonen, subklonen, tot expressie brengen en zuiveren
o Zijn allemaal correct maar sommigen meer kans om te werken of zijn sneller.
- Kloneringskuzes
o Bron van DNA
o Verschillende methodologieën voor DNA-assemblage
- Expressiekeuzes
o Keuze van expressiesysteem (en subkloneringsstrategie)
o Keuze van zuiveringstags (purification tags)
o Keuze van linkers
scFV (IgG)
= single chain variable fragment
- Fv: 3 CDR-lussen waar Ab bindingspotentieel heeft, specifiek voor een bepaald doelwit.
- Voor toepassing: maak scAb MAAR begin met DNA = ½ van Fv gecodeerd in ene gen en
andere ½ gecodeerd in ander gen DUS assembleer 2 genen.
o Samen = klein eiwit: lage glycosylering + niet giftig.
Gastheer kan E. Coli zijn
Expressie kan IPTG systeem zijn
- Hoge zuiverheid nodig
Linkers en tags
- Variëren van een paar AZ tot hele fusiedomeinen
- Tags invloed op: zuivering, lokalisatie, labeling en vouwen.
o Intein tag = sequenties die zichzelf uit een EW kunnen splitsen.
o Impact tag een gemanipuleerd inteïne, gefuseerd met CBD = chitine-binden domein.
CBD zorgt dat getagde EW efficiënt in kolom vastligt + inteïne actief
selectieve elutie van sterk gezuiverd tot expressie gebracht EW.
- Linker = elke EW-sequentie die 2 PoI’s koppelt, die samen TxL ondergaan.
Typische planning
- Plasmide bevat al regulatie van TxN.
- pET met His-tag: snelle zuivering maar niet selectief
o Alternatieve zuiveringsstrategie nodig
- EW-linkers: scheiden individuele componenten van PoI en tussen PoI en zuiveringstag.
- Nu componenten zijn bepaald, kan montage gepland worden, incl. reviseren componenten.
VH = variable heavy VL = variable light: top van IgG, samen vormen ze IgG-bindingsplaats, afkomstig
van een single Ab.
Gebruik intein purificatie tag want we willen hoge zuiverheid, beter dan His-tag.
Je weet hoe je je PoI wil hebben: je kan ook enkele componenten herzien, hier is hoeveelheid
engineering die ik in pET28 moet doen, om alle deze van constructie op te nemen, aanzienlijk kies
om met andere vector te werken (construct in 1w): reduceert probleem = 3 fragmenten ipv 5.
Captaliseer SapI-fragment of SapI endonuclease plaats voor klonering.
, Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies
Kloon de laatste overhang, vanwege flexibiliteit bij samenstellen van fragment, kies ik ook type IIS.
Voorkant kies ik voor een stom uiteinde.
Codeer de linker als primeroverhang: assembleer niet meerdere fragmenten MAAR 2x PCR om
fragment te amplificeren en type IIS samen samen met blunt end kan ik klonen.
GSSGS-EW toevoegen tussen PoI en TEV-tag
- Glycine en Serine = kleine sterke polaire AZ flexibele tag genereren
kans dat TEV-tag beschikbaar is voor proteasen stijgt.
Overhang kiezen voor type IIS-klonen om niets over te laten tussen VL en
purificatie tag.
- SapI plaats in pTX1 plasmide strategisch geplaatst:
o Overhang = sequentie die codeert voor Cysteïne dat later door Inteïn geplitst wordt.
- Als je die overhangende sequentie gebruikt tot expressie gebrachte EW bij Cysteïne
afgesplitst geen enkel toegevoegd AZ blijft achter (IIS = zonder scar).
Linker tussen VL en purificatie tag om purificatie tag te verwijderen
- PT = intein-CBD: activatie inteïne splitsing en afgifte van EW = geen linker nodig.
- PT = His-tag
o Vaak zonder linker
o Indien wel linker: varieert van 1 AZ tot meer gevestigde linker en variaties daarvan.
G4S (variatie = GSSGS)
Biotherapeutische engineering
Reikwijdte
- Punt mutaties, inserties en deleties
- Chemische aanhechting van aanvullende chemische functionaliteit
- Onnatuurlijke AZ
- Tags (zuivering)
- Domein wisselingen (chimere Ab)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller VDSA. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $8.39. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
82191 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now