Biotechnologie Les 3: From gene to protein II
Eerste stappen in discovery
Van gekend target naar therapeutisch proteïne
- Ontdekking gebaseerd op
o Assays om gezochte functie te meten
o Scheidingsmethoden: functies isoleren
o Methoden voor bepalen van identiteit van betreffende molecuul
Geïsoleerd producerend weefsel (insulinoma) van bekend potentieel therapeutisch EW (insuline)
Ga uit van in insulinoma = kankercellijn dat veel insuline produceert
- Aanname: hoog EW-niveau = hoog mRNA-niveau
o NODI voor 1e stap in protocol = RNA isoleren: guanidinium denatureert alle EW of AA
en organische extractie in een CD5 conditie terugwinning van alle RNA’s (r,t,m).
Totaal RNA extract: mRNA kleine fractie 0,3% mRNA codeert voor insuline
Extractie mRNA (RT met een hoge kwaliteit templaat) manier om insuline-mRNA eruit te halen
- Eukaryote cel: polyA-label essentieel voor terugwinnen van mRNA uit cellen.
TxL geïsoleerd mRNA: aantonen dat er insuline geproduceerd werd, gedetecteerd met Ab.
RT met polyT primer, bindt polyA staart in mRNA converteert RNA info terug in DNA.
- Geen introns in volwassen mRNA
- Labeling van terminale transferasen (TdT) om compatibele overhangen te creëren
RT verwarmen: RT denatureren + TdT
Geen SMART-primer: fixeren cellulaire polymerasen 2 e streng (cDNA gemaakt door RT)
Origineel insuline klonen
Klonen van mRNA in plasmide
- Plasmide onbekend plasmide = klassiek moleculair biologisch plasmide
- Gedigereerd met endonuclease = creëert ingangspunt
- TdT met dGTP als substraat
- Tdt geen templaat nodig, iav dGTP creëert poly-G overhang aan 3’end geen
basenparing mogelijk plasmide kan niet ligeren.
plasmide pBR3222 geknipt met PstI,
gezuiverd en geïncubeerd met Tdt + dGTP
plasmide: polyG overhangen, niet re-ligeren
Polymerase = TdT geen templaat: product afh van elke toegevoegd nucleotiden: dGTP dus enkel G.
, Biotechnologie Les 3: From gene to protein II
poly-dT pirmer bindt polyA in mRNA + RT
gesynthetiseerd cDNA behandeld met TdT + dCTP
cDNA = 50% RNA + 50% DNA
polyG en polyC overhangen zijn compatibel en kunnen ligeren
levensvatbaar plasmide gecreëerd.
Na transformatie: kolonies isoleren (degene waarvan sequentie bepaald of
gescreend werd dmv plotten om zeker te zijn dat verwachte sequentie voor
insuline EW aanwezig was)
Insuline isolatie vandaag de dag
Ingangspunt nog steeds RNA, maar snellere manieren.
A) Poly T-primer bindt polyA mRNA geeft priming-plaats die RT kan verlengen.
B) + overhangen (onbekende sequentie, zelf kizen) voor RT-primer
o RT vindt plaats
o DNA klaar + C-overhangen = verder dan DNA, maar indien + SMART-oligo met
korte G-overhang bindt het ontluikende C’s RT blijft synthetiseren tot einde oligo.
onbekende sequentie in 5’ prime van RT + bekende sequentie in SMART-oligo
maakt PCR mogelijk
C) Versnellen: biotine gelabelde primer
o Post-PCR: producten vangen mbv streptavidine-gecoate korrels + proces
stroomafwaarts versnellen.
o Kies overhangs (rood), kies primer sites (blauw)
D) Kan gesequenced, gekloond en gesynthetiseerd worden.
Eerste stappen in discovery
Van gekend target naar therapeutisch proteïne
- Ontdekking gebaseerd op
o Assays om gezochte functie te meten
o Scheidingsmethoden: functies isoleren
o Methoden voor bepalen van identiteit van betreffende molecuul
Geïsoleerd producerend weefsel (insulinoma) van bekend potentieel therapeutisch EW (insuline)
Ga uit van in insulinoma = kankercellijn dat veel insuline produceert
- Aanname: hoog EW-niveau = hoog mRNA-niveau
o NODI voor 1e stap in protocol = RNA isoleren: guanidinium denatureert alle EW of AA
en organische extractie in een CD5 conditie terugwinning van alle RNA’s (r,t,m).
Totaal RNA extract: mRNA kleine fractie 0,3% mRNA codeert voor insuline
Extractie mRNA (RT met een hoge kwaliteit templaat) manier om insuline-mRNA eruit te halen
- Eukaryote cel: polyA-label essentieel voor terugwinnen van mRNA uit cellen.
TxL geïsoleerd mRNA: aantonen dat er insuline geproduceerd werd, gedetecteerd met Ab.
RT met polyT primer, bindt polyA staart in mRNA converteert RNA info terug in DNA.
- Geen introns in volwassen mRNA
- Labeling van terminale transferasen (TdT) om compatibele overhangen te creëren
RT verwarmen: RT denatureren + TdT
Geen SMART-primer: fixeren cellulaire polymerasen 2 e streng (cDNA gemaakt door RT)
Origineel insuline klonen
Klonen van mRNA in plasmide
- Plasmide onbekend plasmide = klassiek moleculair biologisch plasmide
- Gedigereerd met endonuclease = creëert ingangspunt
- TdT met dGTP als substraat
- Tdt geen templaat nodig, iav dGTP creëert poly-G overhang aan 3’end geen
basenparing mogelijk plasmide kan niet ligeren.
plasmide pBR3222 geknipt met PstI,
gezuiverd en geïncubeerd met Tdt + dGTP
plasmide: polyG overhangen, niet re-ligeren
Polymerase = TdT geen templaat: product afh van elke toegevoegd nucleotiden: dGTP dus enkel G.
, Biotechnologie Les 3: From gene to protein II
poly-dT pirmer bindt polyA in mRNA + RT
gesynthetiseerd cDNA behandeld met TdT + dCTP
cDNA = 50% RNA + 50% DNA
polyG en polyC overhangen zijn compatibel en kunnen ligeren
levensvatbaar plasmide gecreëerd.
Na transformatie: kolonies isoleren (degene waarvan sequentie bepaald of
gescreend werd dmv plotten om zeker te zijn dat verwachte sequentie voor
insuline EW aanwezig was)
Insuline isolatie vandaag de dag
Ingangspunt nog steeds RNA, maar snellere manieren.
A) Poly T-primer bindt polyA mRNA geeft priming-plaats die RT kan verlengen.
B) + overhangen (onbekende sequentie, zelf kizen) voor RT-primer
o RT vindt plaats
o DNA klaar + C-overhangen = verder dan DNA, maar indien + SMART-oligo met
korte G-overhang bindt het ontluikende C’s RT blijft synthetiseren tot einde oligo.
onbekende sequentie in 5’ prime van RT + bekende sequentie in SMART-oligo
maakt PCR mogelijk
C) Versnellen: biotine gelabelde primer
o Post-PCR: producten vangen mbv streptavidine-gecoate korrels + proces
stroomafwaarts versnellen.
o Kies overhangs (rood), kies primer sites (blauw)
D) Kan gesequenced, gekloond en gesynthetiseerd worden.
