Summary
Samenvatting materials and methods to analyse your epigenome
- Course
- Institution
samenvatting gebaseerd op de powerpoints en eigen notities
[Show more]
Seller
Followlauraheyndrickx
Reviews received
Content preview
Materials and methods toanalyze your epigenome
Histone modifications
Western blot/ELISA
Antilichamen gemaakt specifiek tegen modificaties van histon aminozuren
o Slechts één modificatie tegelijk bestuderen mogelijk
→ verschillende patiëntenstalen of cellijnen onderzoeken met deze methode wordt
zeer duur, gezien één antilichaam snel €500 zou kosten
Histonen isoleren en antilichamen met fluorescente tag toevoegen
o Met toenemende hoeveelheid van bepaalde modificatie fluorescentie meten
→ simpelste methode om te weten of histon gemodificeerd is
o Probleem: verschillende labo’s gebruiken verschillende commerciële bronnen van
antilichamen
Bv: één commerciële bron van antilichamen herkende enkel fosforylatie van
S10 indien K9 tegelijk ook geacetyleerd was
Soms kan fosfo-antilichaam niet herkent worden als er een
acetylgroep gebonden zijn op K9 = epitoop-occlusie
K9 kan ook gemethyleerd worden naast acetylatie
→ tegenstrijdige resultaten kunnen verkregen worden
Proteomics
Eiwit verknippen met protease en dan alle peptides scheiden op basis van verschil in massa
o Extractie van histonen bij een heel zure pH (HCl of H 2SO4)
→ enkel histonen gaan in oplossing, andere structuren gaan kapot
Via proteases histonen verknippen in peptides
o Peptides kennen een massa, maar als er acetylgroep of methylgroep op zit zal er een
verschuiving in massa optreden
Alle mogelijke combinaties per peptide geeft 64 mogelijke
massaverschuivingen voor een peptide met 3 lysines
Een aantal combinaties geven dezelfde massaverschuivingen
→ Trainen van computers om deze verschuivingen te analyseren
Patroon van peptide zal uiteindelijk wel verkregen worden, maar de
rekentijd om de modificaties te achterhalen wordt astronomisch
groot
Staal van histonen in proteoommachine steken en zoeken naar clusters
o Massaverschuivingen zoeken en onderzoeken waar pieken zich bevinden
→ zoeken van patronen
Patronen kunnen mogelijks wijzen op bepaalde zaken
Gezien volledige dataset lange rekentijd zou innemen, wordt de dataset vereenvoudigd tot
50 meest voorkomende clusters → hierop meer gedetailleerde analyse uitvoeren
1
, Immunofluorescentie
Onderzoeken of specifieke histonvarianten wel of niet aanwezig zijn
o Co-localisatie van bepaalde modificaties
Antilichaam gebasseerde methode, dus altijd gevaar voor epitoop-occlusie
o Bias mogelijk door de te weinig specificiteit van de antilichamen voor modificaties
o Ook rekening houden met de emissiespectra van fluoroforen
Spectra kunnen interfereren en extra bias geven
Als pieken te dicht bij elkaar zitten, maakt dit dat signalen niet meer
correct kunnen geïdentificeerd worden
Mass spect cytometry
In plaats van antilichamen te labelen met fluorescente kleurstoffen worden er metalen
gebonden met elk verschillende isotoopmassa
o Beads met unieke masse → niet langer kijken naar lichtsignaal, maar naar de
aan-/afwezigheid van bepaalde massas
50 antilichamen allen tegen verschillende histonmodificaties met allen ander metaal label
→ signaal van bepaalde massa is aan of afwezig indien modificaties aan of afwezig is
o Op deze manier kunnen tot 135 verschillende antilichamen tegelijk kwantificeren,
wat onmogelijk was met immunofluorescentie of flowcytometrie
Chromatine immunoprecipitatie
Cellen crosslinken aan DNA met formaldehyde → ChIP-base gevormd
o Base reageert met lysine en nadien met cytosine
→ lysine van histonen binden met cytosine van DNA
Sonicatie (ultrasone trillingen of enzymatisch) zal lengte reduceren
→ fragmentjes van DNA gevormd met allen bepaalde modificaties
o Antilichamen toevoegen tegen specifieke modificaties
Maar één per staal mogelijk
Antilichaam bindt op nucleosoom met bepaalde modificatie
Immunoprecipitatie: cefarose beads toevoegen aan mengsel met affiniteit voor antilichamen
→ beads kleven aan antilichamen → zware bead gevormd → chromatine DNA
geprecipiteerd
o Aan bodem epje zitten fragmenten gebonden aan beads
Om te weten welk stukje DNA gebonden is hebben we reverse crosslinking
nodig → staal opwarmen maakt dat histonen loskomen van DNA
→ isoleren van DNA → PCR uitvoeren
Enkele verschillen tegenover de proteoom analyse
o Bij proteoom: alle histonen uit de cel halen, zonder te weten aan welk DNA ze kleven
o Bij ChIP: door crosslinking geweten welke DNA fragmenten aanwezig zijn
Met PCR nadien zien of DNA in bound of unbound fractie zat van de beads
Ook mogelijk om in plaats van PCR of hybridisatie op het einde een next generation
sequencing uit te voeren op alle geprecipiteerde fragmenten → ChIP-QPCR
o Pieken zijn fragmenten die geacetyleerde histonen dragen
Van elke histonmodificatie geweten waar in het genoom deze aanwezig is
→ map maken van histonnmodificaties waarvan antilichamen gekend zijn
Probleem: heel veel cellen nodig voor chromatine precipitatie
→ botsen zo op limieten van sensitiviteit
2
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lauraheyndrickx. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.77. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
56326 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now