Samenvatting - Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1: Hoofdstuk 13
8 views 0 purchase
Course
Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Dit is een samenvatting van hoofdstuk 13 uit het vak methoden in het biomedisch onderzoek 1 - analyse va het DNA.
Gebaseerd op de lessen en slides, bevat figuren uit de powerpoint.
2. DNA extraheren
Algemeen principe
1. Lysis = afbreken van cellen zodat het DNA vrijkomt
→ lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen
2. Isoleren = DNA uit het lysaat halen of opzuiveren
→ RNA en eiwitten verwijderen
3. Oplossen = DNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, hierbij
concentreer je het DNA ook
Lyseren
- Vaak toevoegingen:
o Remmers van niet-gewenste moleculen: RNasen, proteasen,…
o EDTA = complexeert Mg2+ waardoor die wordt afgeschermd van DNase → DNase
inactief, anders wordt DNA afgebroken
- Lysis mbv detergent
o Meest gebruikte methode → snel, reproduceerbaar, geen specifieke apparatuur
o Bij celculturen toegepast
o Hydrofiele kop en hydrofobe kop
Verdund voorkomen: monomeer
Hoge concentratie in oplossing: micelle met hydrofiele koppen naar
buiten en hydrofobe staarten naar elkaar gericht
, o Milde detergent (CHAPS, triton, ...)
= behoud van celorganellen mogelijk + tragere lysis
o Harde detergent (SDS, …)
= ook organellen worden opengebroken + proteïnedenaturatie
o Principe van detergent
Lipiden monomeren nestelen zich in het lipiden dubbelmembraan
Buitenste membraan wordt langer als binnenste → membraan krijgt licht
kromming
Op een bepaald moment: te harde buiging en membraan knapt open →
gaten in membraan
Langs opening gaten worden er eerst halve micellen en uiteindelijk hele
micellen gevormd
- Mechanische methoden voor lysis
o Voor DNA is dit vaak te bruut, daarom dat men meestal detergenten prefereert
o Sonicator: hoge frequentiegolven maken ook het DNA kapot → vermijden als je
DNA wilt analyseren
- DNA uit bloed lyseren
o Anticoagulans = anti-bloedstolling → EDTA, want heparine inhibeert DNA reacties
o NH4Cl → lyseert cellen zonder kern (bv RBC → heemgroepen kunnen verdere
analyse inhiberen)
o Men wilt de WBC → met kern en dus DNA
→ verder gaan zoals bij de cellen
- DNA uit weefsels lyseren
o In kleine stukjes disseceren
o Met vloeibare stikstof → in mortier met pestel pletten tot een
poeder
, → verder gaan zoals bij cellen
- DNA uit cellen lyseren: met buffer
o SDS = detergent → afbreken membraan + eiwitten
o Enzymes: eiwitten en RNA afbreken
o EDTA: complexeert Mg → inhibitie DNase
DNA isoleren
- Organische solventen
o Scheiding DNA, RNA en eiwitten op basis van verschillende oplosbaarheid in
verschillende niet-mengbare vloeistoffen
o Voeg phenol-chloroform-isoamyl extractie toe + vortex (mengen)
Phenol → denatureert eiwitten + minder polair dan water waardoor DNA
hier niet zal in oplossen
Chloroform → verhoogt efficiëntie van eiwit denaturatie + denatureert
lipiden
Isoamyl → vermindert schuimvorming
o Centrifugeer
Pellet = organische fase met lipiden + interfase met proteïnen
Supernatans = waterige fase met DNA
o Breng waterige fase over in nieuwe eppendorf
→ nadeel van deze manier: restanten van organische solventen in DNA + stoffen zijn
corrosief en toxisch
- Geconcentreerd zout
o Principe
Voeg NaCl toe en centrifugeer → onttrekt sneller water van rond de
eiwitten dan rond DNA → eiwitten slaan neer en vormen pellet
Supernatans bevat DNA → overbrengen naar nieuwe eppendorf
o Voordeel: eenvoudig, goedkoop en goede opbrengst & zuiverheid
o Na salting out & na phenol-chloroform extractie → ethanol precipitatie
(neerslaan van DNA) voor verdere opzuivering en concentratie van DNA (zie
verder)
- Kolomchromatografie
o Principe
Bepaalde condities van zout en pH zorgen ervoor dat DNA aan matrix van
kolom bindt
Andere condities zorgen voor elutie = vrijzetten van DNA
o Drijvende krachten van beweging doorheen kolom
Centrifugatie
Zwaartekracht
Vacuüm
o Verschillende types
Silica kolom
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller laurebrants. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.34. You're not tied to anything after your purchase.
