Samenvatting - Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1: hoofdstuk 12
4 views 0 purchase
Course
Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Dit is een samenvatting van hoofdstuk 12 uit het vak Methoden in het biomedisch onderzoek 1: Celbiologische methoden.
Gebaseerd op de slides en het hoorcollege, bevat figuren uit de powerpoint.
Hoofdstuk 12: celbiologische methoden
→ biologisch functioneren van cellen (ze doen aan allerhande processen) en deze processen kunnen
weergeven mbv specifieke methoden
1. Flow cytometrie
- Flow cytometrie: informatie over individuele cellen!!
o Bepalen welk % van de cellen een bepaalde merker bevat
- Vergelijkbaar met FACS (hfdst 3 en 8) maar ipv scheiding van cellen op het einde gaan ze
gewoon in de vuilbak
- Algemeen principe:
o Cellen analyseren adhv merkers die aangekleurd worden door fluorescent gelabelde
antilichamen
o Expressieprofiel van markers op cellen
Op celoppervlak
Intracellulair → plasmamembraan moet eerst toegankelijk gemaakt worden:
gaatjes in membraan gemaakt = permeabilisatie van membraan
o Gaan door buis en worden belicht door laser → op basis van licht dat wordt
teruggekaatst kan de detector een beeld geven van welke cellen er aanwezig zijn
- Je kan meerdere merkers tegelijk gebruiken!!
- Negatieve controle
= cellen worden niet gemerkt met fluorescente merker, maar doorlopen zelfde proces
→ achtergrondsignaal
→ nodig om grens tussen positief en negatief resultaat te trekken
- Resultaten worden weergegeven in
2. Celproliferatie
- BrdU test: celproliferatie meten
- Principe: BrdU = bromodeoxyuridine → thymidine analoog → tijdens S-fase ingebouwd ipv
Thymidine
- Werkwijze
o Cellen laten opgroeien
o BrdU toevoegen voor een 4-tal uur en verder laten groeien → BrdU wordt ingebouwd
in DNA tijdens S-fase
o Antilichaam Cy5 tegen BrdU toevoegen:
Cel permeabiliseren (membraan toegankelijk maken zodat Cy5 in kern
terecht kan komen)
Cy5 toevoegen
, o Merker meten → histogram
- Resultaat interpreteren:
o Blauwe lijn = negatieve controle
o Gele pieken = plekken waar cel prolifereert
2 pieken = 2 populaties
1e piek is onder blauwe controle = geen BrdU
aanwezig = niet actief aan het delen
2e piek = wel BrdU aanwezig = wel actief aan het
delen
3. Celleefbaarheid
- MTT test: aantal levende cellen bepalen
- Principe:
Levende, intacte cellen hebben levende, intacte mitochondriën; deze litochondriën bevatten
mitochondriaal dehydrogenase die geel MTT kunnen omzetten in paars formazan
→ paarse kleuring is evenredig met aantal levende cellen
- Werkwijze
o Cellen laten groeien in 96-well plaat
o Gele MTT oplossing toevoegen en enkele uren laten incuberen in celcultuurincubator
o Optische densiteit/ absorptie meten op multi-well plaatlezer (= spectrofotometer)
→ hoe paarser, hoe meer levende en intacte cellen
- LET OP: dit is een indirecte meting!! Je moet opletten als je andere producten gaat gebruiken
die ook effect gaan hebben op aanwezige enzymen/ mitochondriale activiteit
4. Celdood
- Tunel test: meten van apoptose (breuken in DNA = dood)
o Principe: bij cellen in apoptose is er fragmentatie van DNA, hierdoor kan men Br-
dUTP inbouwen adhv enzyme TdT (= Terminaal deoxynucleotidyl Transferase)
o Werkwijze
Weefselcoupe of celsuspensie (maken en) FIXEREN & permeabiliseren
TdT en Br-dUTP toevoegen
Antilichaam tegen Br-dUTP toevoegen → ingebouwd Br-dUTP detecteren
Detectie met fluorescentie of histochemische kleuring
Histochemie: kleuring → apoptotische cel wordt bruin gekleurd
- Propidium Iodide flow cytometrie: dode cellen tellen
o Principe: Propidium Iodide = PI kan enkel in dode cellen binnendringen → celkern:
binden aan DNA = intercaleren → geeft fluorescent signaal
o Werkwijze
Cellen incuberen met PI
Flow cytometrie
PI fluorescentie → meer fluorescent signaal = meer PI = dode cel
Forward Scatter (FSC) = “schaduw van de cel” → maat voor grootte
van de cel: levende cellen hebben grotere FSC dan dode cellen
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller laurebrants. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.30. You're not tied to anything after your purchase.
