MBE Meetrapport Eiwitchromatografie met AKTA
Leerjaar 2 Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek MBE
Doel Eiwitchromatografie met AKTA
Bij eiwitchromatografie met behulp van het AKTA-systeem worden er eiwitten gezuiverd. Het is een
scheidingstechniek waarbij een eiwitmengsel gescheiden kunnen worden op basis van verschillende
eigenschappen. Het AKTA-systeem kan eiwitten zuiveren op basis van grootte, pI en affiniteit.
In deze proef wordt er gebruik gemaakt van een DEAE-kolom voor het zuiveren van tyrosinase. De
DEAE-kolom is een zwakke anion exchanger die eiwitten bindt op basis van pI. Door een bepaalde
buffer met pH te kiezen kunnen we de pH van tyrosinase bepalen en hier gebruik van maken op de
kolom. De DEAE-kolom bindt negatief geladen eiwitten. Tyrosinase moet door de bindingsbuffer dus
een negatieve lading krijgen. Vervolgens wordt er een elutiebuffer gebruikt om de eiwitten aan de
kolom te elueren en op te vangen in fracties.
Verwachting Eiwitchromatografie met AKTA
In de onderstaande afbeelding 1 is de verwachting van de resultaten van de eiwitchromatografie met
het AKTA-systeem weergeven.
Afbeelding 1: verwachting resultaat AKTA
Blauw: eiwitten
Oranje: elutiebuffer (buffer B)
Groen: geleidbaarheid kolom
, De eerste blauwe piek in afbeelding 1 is de doorloop van de eiwitten die niet aan de DEAE-kolom
zullen binden. Deze komen dan gelijk van de kolom af en belanden in de fracties van het AKTA-
systeem. De tweede blauwe piek is de elutie van de eiwitten die aan de DEAE-kolom gebonden
waren. Door het toevoegen van de elutiebuffer, zie de oranje lijn, komen de gebonden eiwitten
vervolgens van de kolom vrij en belanden deze vervolgens ook in de fracties. Door het toevoegen van
de elutiebuffer, neemt de geleidbaarheid van de kolom toe. De elutiebuffer bevat namelijk het zout
NaCl. De toename van de geleidbaarheid is te zien als groene lijn.
Er is ook data van school verkregen. Zij hebben met behulp van eiwitchromatografie met het AKTA-
systeem de hoeveelheid en de activiteit eiwit gemeten. Aan de hand van deze data kan ook een
verwachting voor het resultaat worden opgesteld. Er zijn 5 fracties uit deze meting genomen, de data
van deze fracties is weergeven in onderstaande tabel 1.
Tabel 1: A475 gemeten data van school
Seconden Ongezuiverd Fractie 1 Fractie 2 Fractie 12 Fractie 13
0 0,288 0,111 0,151 0,134 0,180
10 0,304 0,116 0,157 0,149 0,186
20 0,326 0,124 0,165 0,165 0,198
30 0,342 0,134 0,172 0,177 0,200
40 0,358 0,135 0,183 0,182 0,216
50 0,376 0,14 0,189 0,199 0,223
60 0,391 0,144 0,195 0,213 0,230
In fractie 1 en fractie 2 wordt de doorloop van de eiwitten die niet aan de DEAE-kolom binden
verwacht. In fractie 12 en 13 wordt de elutie van de eiwitten die aan de kolom binden verwacht. De
hoeveelheid eiwitten uit de doorloop is hoger dan de hoeveelheid eiwitten uit de elutie. Er wordt dus
een hogere activiteit verwacht bij de doorloopfracties.
Leerjaar 2 Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek MBE
Doel Eiwitchromatografie met AKTA
Bij eiwitchromatografie met behulp van het AKTA-systeem worden er eiwitten gezuiverd. Het is een
scheidingstechniek waarbij een eiwitmengsel gescheiden kunnen worden op basis van verschillende
eigenschappen. Het AKTA-systeem kan eiwitten zuiveren op basis van grootte, pI en affiniteit.
In deze proef wordt er gebruik gemaakt van een DEAE-kolom voor het zuiveren van tyrosinase. De
DEAE-kolom is een zwakke anion exchanger die eiwitten bindt op basis van pI. Door een bepaalde
buffer met pH te kiezen kunnen we de pH van tyrosinase bepalen en hier gebruik van maken op de
kolom. De DEAE-kolom bindt negatief geladen eiwitten. Tyrosinase moet door de bindingsbuffer dus
een negatieve lading krijgen. Vervolgens wordt er een elutiebuffer gebruikt om de eiwitten aan de
kolom te elueren en op te vangen in fracties.
Verwachting Eiwitchromatografie met AKTA
In de onderstaande afbeelding 1 is de verwachting van de resultaten van de eiwitchromatografie met
het AKTA-systeem weergeven.
Afbeelding 1: verwachting resultaat AKTA
Blauw: eiwitten
Oranje: elutiebuffer (buffer B)
Groen: geleidbaarheid kolom
, De eerste blauwe piek in afbeelding 1 is de doorloop van de eiwitten die niet aan de DEAE-kolom
zullen binden. Deze komen dan gelijk van de kolom af en belanden in de fracties van het AKTA-
systeem. De tweede blauwe piek is de elutie van de eiwitten die aan de DEAE-kolom gebonden
waren. Door het toevoegen van de elutiebuffer, zie de oranje lijn, komen de gebonden eiwitten
vervolgens van de kolom vrij en belanden deze vervolgens ook in de fracties. Door het toevoegen van
de elutiebuffer, neemt de geleidbaarheid van de kolom toe. De elutiebuffer bevat namelijk het zout
NaCl. De toename van de geleidbaarheid is te zien als groene lijn.
Er is ook data van school verkregen. Zij hebben met behulp van eiwitchromatografie met het AKTA-
systeem de hoeveelheid en de activiteit eiwit gemeten. Aan de hand van deze data kan ook een
verwachting voor het resultaat worden opgesteld. Er zijn 5 fracties uit deze meting genomen, de data
van deze fracties is weergeven in onderstaande tabel 1.
Tabel 1: A475 gemeten data van school
Seconden Ongezuiverd Fractie 1 Fractie 2 Fractie 12 Fractie 13
0 0,288 0,111 0,151 0,134 0,180
10 0,304 0,116 0,157 0,149 0,186
20 0,326 0,124 0,165 0,165 0,198
30 0,342 0,134 0,172 0,177 0,200
40 0,358 0,135 0,183 0,182 0,216
50 0,376 0,14 0,189 0,199 0,223
60 0,391 0,144 0,195 0,213 0,230
In fractie 1 en fractie 2 wordt de doorloop van de eiwitten die niet aan de DEAE-kolom binden
verwacht. In fractie 12 en 13 wordt de elutie van de eiwitten die aan de kolom binden verwacht. De
hoeveelheid eiwitten uit de doorloop is hoger dan de hoeveelheid eiwitten uit de elutie. Er wordt dus
een hogere activiteit verwacht bij de doorloopfracties.
