Samenvatting histologie
Microscopische technieken 1e Ba BMW
inleiding:
- microscoop voldoen aan 3 functies: vergroot beeld maken (vergroting), details kunnen scheiden in beeld
(resolutie) en details zichtbaar maken (contrast)
- blote oog: moet minimaal 100-200µm van elkaar verwijderd zijn
LM: tot 0,2µm waarnemen (mitochondriën op grens van LM)
EM: 450000x vergroting met resolutie 0,1 nm
- d zo klein mogelijk? lambda zo klein mogelijk, noemer zo
groot mogelijk.
Samenstelling LM:
- Antoni van Leeuwenhoek 17e eeuw
- minimaal 2 lenzen (samengesteld)
- de mens ziet een virtueel beeld langs dezelfde kant vh objectief als het object
vorming van een vergroot omgekeerd, reëel tussenbeeld tss objectief & oculair
- onderdelen samengehouden door statief
- preparaat tafel meestal beweeglijk
- condensor = set lenzen die lichtstralen opvangt
en via breking tot een coherente, relatief smalle
bundel herleid. gelijkmatige en maximale
belichting
- in condensor condensor diafragma (= velddiafragm.)
hierdoor mogelijk belichting optimaal te maken
(= methode van Köhler)
- de lenzen op de objectiefverwisselaar zorgen voor
meeste vergroting. dit beeld nog eens vergroot
door oculairlens. (VERGRtot= VERGRobjX VERGRocl)
Resolutie en numerieke apertuur:
- Resolutie = scheidend/oplossend vermogen vermogen om 2 punten afzonderlijk waar te nemen (LM 0,2 µm)
λ = golflengte vd belichting
NA = numerieke apertuur vd objectieflens
NA= n x sin µ NA kwaliteitswaardemeter voor het objectief
n = brekingsindex µ = halve tophoek vd apertuurkegel
- Hoe hoger NA hoe beter de resolutie want R daalt, hoe kleiner de golflengte hoe beter R
een lagere belichtingsintensiteit heeft een lagere resolutie tot gevolg
- Er is geen onbeperkte vergroting mogelijk
- Licht draaggaasje coupe dekglaasje lens = beeldvorming (omgekeerde volgorde = te grote breking
= onscherp)
- vb. lens
63 is de vergroting
Plan-apochromaat --> waarvoor de lens het meest geschikt is
1,4 is de NA
0,17 wijst op de dikte van het dekglas waarvoor de lens is gecorrigeerd
1
, Samenvatting histologie
Microscopische technieken 1e Ba BMW
Voorbereiding van een preparaat voor conventionele lichtmicroscopie:
- eenvoudig om te maken is een uitstrijkje van cellen in suspensie
- prac. Histo weefselsnede/coupe
- hoe?
orgaan/weefsel verwijderd
gefixeerd door perfusie (de toevoer van een vloeistof door het bloedvatenstelsel of lymfevatenstelsel naar een bepaald
orgaan of weefsel) (via bloedbaan) of immersie (onderdompelen in bv. Formaldehyde)
worden chemische verbn (cross-linking van eiwitten) tss fixatief en de bmc in het weefsel
spoelen, hydrateren met ethanol en inbedden in parrafine
het weefsel ingebed in paraffine geplaatst in microtoom (gaat zeer dunne schijfjes snijden vh weefsel)
2-7µm dik gelegd in draagglaasje
omgekeerde alcoholreeks terug in waterig milieu gebracht voor kleuring
(ongekleurd weefsel = breking glas weinig zichtbaar)
na kleuring opnieuw ontwaterd om in te bedden in niet-waterig inbeddingsmedium (bv. Permount)
- Zo tegengaan degradatie door bacteriën/enzymen (autolyse) de ultrastructuur ve weefsel blijft bewaard
- soorten kleuringen: hematoxyline/eosine HE-kleuring
hematoxyline = basisch, bindt op zuur materiaal vh weefsel (bv. Nucleïnezuren)
eosine = zuur, roze, bindt op basisch materiaal
Andere veel gebruikte microscopische technieken als aanvulling op de klassieke lichtmicroscopie met
doorvallende belichting.:
Fasecontrastmicroscopie:
- Fasecontrasttechniek = op de plaats vd faseverschillen die het object veroorzaakt,
kunstmatige helderheidsverschillen aanbrengen juiste geometrische vorm vd details
worden getoond
- Lichtgolven die op diverse plaatsen door een dergelijk preparaat heengaan verschillen niet
in amplitude (zelfde brekingsindex) (intensiteit), maar alleen in hun ‘fase’ fase niet waar
te nemen met oog
er treedt dus geen kleuring op ( handig voor werken met levende cellen, kleuring soms toxisch)
Donkerveldmicroscopie:
- Er valt geen direct, rechtlijnig uit de condensor komend, licht in het objectief.
Alleen door de objectstructuur afgebogen en verstrooid licht levert een bijdrage
aan de beeldvorming.
laat toe om levende cellen te bestuderen.
2
Microscopische technieken 1e Ba BMW
inleiding:
- microscoop voldoen aan 3 functies: vergroot beeld maken (vergroting), details kunnen scheiden in beeld
(resolutie) en details zichtbaar maken (contrast)
- blote oog: moet minimaal 100-200µm van elkaar verwijderd zijn
LM: tot 0,2µm waarnemen (mitochondriën op grens van LM)
EM: 450000x vergroting met resolutie 0,1 nm
- d zo klein mogelijk? lambda zo klein mogelijk, noemer zo
groot mogelijk.
Samenstelling LM:
- Antoni van Leeuwenhoek 17e eeuw
- minimaal 2 lenzen (samengesteld)
- de mens ziet een virtueel beeld langs dezelfde kant vh objectief als het object
vorming van een vergroot omgekeerd, reëel tussenbeeld tss objectief & oculair
- onderdelen samengehouden door statief
- preparaat tafel meestal beweeglijk
- condensor = set lenzen die lichtstralen opvangt
en via breking tot een coherente, relatief smalle
bundel herleid. gelijkmatige en maximale
belichting
- in condensor condensor diafragma (= velddiafragm.)
hierdoor mogelijk belichting optimaal te maken
(= methode van Köhler)
- de lenzen op de objectiefverwisselaar zorgen voor
meeste vergroting. dit beeld nog eens vergroot
door oculairlens. (VERGRtot= VERGRobjX VERGRocl)
Resolutie en numerieke apertuur:
- Resolutie = scheidend/oplossend vermogen vermogen om 2 punten afzonderlijk waar te nemen (LM 0,2 µm)
λ = golflengte vd belichting
NA = numerieke apertuur vd objectieflens
NA= n x sin µ NA kwaliteitswaardemeter voor het objectief
n = brekingsindex µ = halve tophoek vd apertuurkegel
- Hoe hoger NA hoe beter de resolutie want R daalt, hoe kleiner de golflengte hoe beter R
een lagere belichtingsintensiteit heeft een lagere resolutie tot gevolg
- Er is geen onbeperkte vergroting mogelijk
- Licht draaggaasje coupe dekglaasje lens = beeldvorming (omgekeerde volgorde = te grote breking
= onscherp)
- vb. lens
63 is de vergroting
Plan-apochromaat --> waarvoor de lens het meest geschikt is
1,4 is de NA
0,17 wijst op de dikte van het dekglas waarvoor de lens is gecorrigeerd
1
, Samenvatting histologie
Microscopische technieken 1e Ba BMW
Voorbereiding van een preparaat voor conventionele lichtmicroscopie:
- eenvoudig om te maken is een uitstrijkje van cellen in suspensie
- prac. Histo weefselsnede/coupe
- hoe?
orgaan/weefsel verwijderd
gefixeerd door perfusie (de toevoer van een vloeistof door het bloedvatenstelsel of lymfevatenstelsel naar een bepaald
orgaan of weefsel) (via bloedbaan) of immersie (onderdompelen in bv. Formaldehyde)
worden chemische verbn (cross-linking van eiwitten) tss fixatief en de bmc in het weefsel
spoelen, hydrateren met ethanol en inbedden in parrafine
het weefsel ingebed in paraffine geplaatst in microtoom (gaat zeer dunne schijfjes snijden vh weefsel)
2-7µm dik gelegd in draagglaasje
omgekeerde alcoholreeks terug in waterig milieu gebracht voor kleuring
(ongekleurd weefsel = breking glas weinig zichtbaar)
na kleuring opnieuw ontwaterd om in te bedden in niet-waterig inbeddingsmedium (bv. Permount)
- Zo tegengaan degradatie door bacteriën/enzymen (autolyse) de ultrastructuur ve weefsel blijft bewaard
- soorten kleuringen: hematoxyline/eosine HE-kleuring
hematoxyline = basisch, bindt op zuur materiaal vh weefsel (bv. Nucleïnezuren)
eosine = zuur, roze, bindt op basisch materiaal
Andere veel gebruikte microscopische technieken als aanvulling op de klassieke lichtmicroscopie met
doorvallende belichting.:
Fasecontrastmicroscopie:
- Fasecontrasttechniek = op de plaats vd faseverschillen die het object veroorzaakt,
kunstmatige helderheidsverschillen aanbrengen juiste geometrische vorm vd details
worden getoond
- Lichtgolven die op diverse plaatsen door een dergelijk preparaat heengaan verschillen niet
in amplitude (zelfde brekingsindex) (intensiteit), maar alleen in hun ‘fase’ fase niet waar
te nemen met oog
er treedt dus geen kleuring op ( handig voor werken met levende cellen, kleuring soms toxisch)
Donkerveldmicroscopie:
- Er valt geen direct, rechtlijnig uit de condensor komend, licht in het objectief.
Alleen door de objectstructuur afgebogen en verstrooid licht levert een bijdrage
aan de beeldvorming.
laat toe om levende cellen te bestuderen.
2
