Summary
Samenvatting Methoden 2 - deel 4 eiwitten
- Course
- Institution
Methoden 2 - deel 4 eiwitten
[Show more]
Seller
Follow
paulinebal
Reviews received
Content preview
2.4 EiwittenIsoleren van eiwitten
Homogenisatie dmv homogenisatiebuffer + verdere opzuivering (vaak)
Startmateriaal (staal) → ruw eiwitlysaat
Opbouw homogenisatiebuffer
• pH buffer bv Tris (pHbuffer = 7,5 = pHcel) <> bij bv. lysosoomale eiwitten zuurdere pH
→ pH bepaald Q => oplosbaarheid en activiteit eiwit
• Zout bv. NaCl
=> geen denaturatie + goed oplossen
• Proteasen inhibitor => geen afbraak eiwit
=> ≠ proteasen => bindt AZ/metaal in de katalytische site => inhibitie katalyse
=> tablet: mengsel meerdere protease inhibitoren
!met/zonder EDTA (als activiteit doel-eiwit beinvloed door EDTA bv. DNAsen)
o PMSF, BZA, aprotinine => serine proteasen bv.trypsine, thrombine, kaklikreine
o EDTA => Metalloproteasen
o Leupeptine => Cysteine proteasen (/thiol)
o Pepstatine => Aspartaat proteasen bv.pepsine, renine, cathepsine
• Event. Fosfatase inhibitor => geen defosforylatie
=> vaak mengsel meerdere
o NaFloride, NaPyrofosfaat, B-glycerofosfaat => Ser-/threonine fosfatasen
o NaOthovanadaat => Tyrosine fosfatasen
• Event. Detergent bv. NP40, Trition-X100, CHAPS,SDS
=> oplossen celmembraan, bij eiwitten die niet oplossen in H2O-opl.
• Event. Reducerend stof bv. DTT, 2-mercapto-ethanol
=> bregen SS-bruggen
Verdere opzuivering eiwitten
Chromatografie of elektroforese
Aanmaken van eiwitten
Doel
- Eiwit functie/structuur bestuderen, antistoffen zoeken tegen eiwit
- Eiwitmedicijn: antillichaam (tegen bepaald eiwit)/hormoon/enzym
- In waspoeder (lipasen,..) en voeding (enzymen,…)
Chemische synthese in vitro
Werking: synthese van C → N-terminus
1) Koppeling harsparel+peptidelinker aan carboxyterminus AZ
→ beschermingsgroep op N-terminus en zijketens AZ => bindt niet
2) Verwijder bescherming N-terminus
3) Koppeling C-terminus nieuw AZ (met protectie) aan N-terminus vorige
4) Repetitie
5) N en zijketen deprotectie + afklieven eiwit van hars en linker
=> °eiwit
, Pos: de novo synthese artificiële eiwitten (AZ die niet in natuur voorkomen)
niet toxisch voor organisme + onafh. AZ-beschikbaarheid
Neg: duur, enkel kleine hoeveelheden
koppelingsefficiëntie per cyclus (1AZ) = 99% => enkel korte seq. (max. 50 AZ) 1%fout
→ oplossing: langer eiwit door koppelen 2 peptiden van 50AZ
↳neem N-protectie af van peptide1 en harsparel van peptide2 (vrije carboxy)
Toep: maken artificiële eiwitten, peptiden voor antistofproductie
Enzymatische synthese in vitro
In vitro translatie RNA in konijn reticulocyt lysaat (of terwekiem extract)
↳ gespecialiseerde TLN machinerie: ribosomen, AZ, E (+geen DNA)
Kan 1e in vitro TXN (DNA→RNA), daarna in vitro TLN (in 2 of 1 reacties)
Pos: snel, eenvoudig
Neg: kleine hoeveelheden
Toep: bepalen ORF (welke AUG van RNA is startcodon)
structurele en functionele studie (impact mutatie)
In vivo expressie systemen
!voor en nadelen organismes
Recombinante eiwitproductie:
1e recombinant DNA in plasmide kloneren => in organisme: TXN + TLN → recombinant eiwit
=> eiwit vrij door lyseren cellen/ secretie in medium
Gekozen organisme bepaalt expressie plasmide
Codon optimisatie:
Genetische code = gedegenereerd: synonieme codons => zelfde AZ
→ abundantie codon afh. organisme/celtype => keuze codon afh. #tRNAs voor codon aanwezig
Dus ∆DNA sequentie naar aanwezigheid tRNAs => ∆ snelheid TLN (<> gelijke eiwitsequentie)
→ Hogere eiwitexpressie als veel tRNAs voor dat codon aanwezig
Transiente eiwitproductie:
- Korte periode (dagen)
- dmv transfectie: geen integratie recombinant DNA in genoom organisme => DNA in cellen
verdunt
Stabiele eiwitproductie:
- Lange periode (maanden)
- dmv transductie: recombinantie DNA in genoom gastheer => blijft in dochtercellen aanwezig
Productie op laboratoriumschaal (1ml cryotube-1L fles) vs industriele schaal (opschalen tot max
1000L
↳ 1-10x106 cellen ↳ 300x109 cellen tank)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller paulinebal. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.89. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
62890 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now