2.4 Eiwitten
Isoleren van eiwitten
Homogenisatie dmv homogenisatiebuffer + verdere opzuivering (vaak)
Startmateriaal (staal) → ruw eiwitlysaat
Opbouw homogenisatiebuffer
• pH buffer bv Tris (pHbuffer = 7,5 = pHcel) <> bij bv. lysosoomale eiwitten zuurdere pH
→ pH bepaald Q => oplosbaarheid en activiteit eiwit
• Zout bv. NaCl
=> geen denaturatie + goed oplossen
• Proteasen inhibitor => geen afbraak eiwit
=> ≠ proteasen => bindt AZ/metaal in de katalytische site => inhibitie katalyse
=> tablet: mengsel meerdere protease inhibitoren
!met/zonder EDTA (als activiteit doel-eiwit beinvloed door EDTA bv. DNAsen)
o PMSF, BZA, aprotinine => serine proteasen bv.trypsine, thrombine, kaklikreine
o EDTA => Metalloproteasen
o Leupeptine => Cysteine proteasen (/thiol)
o Pepstatine => Aspartaat proteasen bv.pepsine, renine, cathepsine
• Event. Fosfatase inhibitor => geen defosforylatie
=> vaak mengsel meerdere
o NaFloride, NaPyrofosfaat, B-glycerofosfaat => Ser-/threonine fosfatasen
o NaOthovanadaat => Tyrosine fosfatasen
• Event. Detergent bv. NP40, Trition-X100, CHAPS,SDS
=> oplossen celmembraan, bij eiwitten die niet oplossen in H2O-opl.
• Event. Reducerend stof bv. DTT, 2-mercapto-ethanol
=> bregen SS-bruggen
Verdere opzuivering eiwitten
Chromatografie of elektroforese
Aanmaken van eiwitten
Doel
- Eiwit functie/structuur bestuderen, antistoffen zoeken tegen eiwit
- Eiwitmedicijn: antillichaam (tegen bepaald eiwit)/hormoon/enzym
- In waspoeder (lipasen,..) en voeding (enzymen,…)
Chemische synthese in vitro
Werking: synthese van C → N-terminus
1) Koppeling harsparel+peptidelinker aan carboxyterminus AZ
→ beschermingsgroep op N-terminus en zijketens AZ => bindt niet
2) Verwijder bescherming N-terminus
3) Koppeling C-terminus nieuw AZ (met protectie) aan N-terminus vorige
4) Repetitie
5) N en zijketen deprotectie + afklieven eiwit van hars en linker
=> °eiwit
, Pos: de novo synthese artificiële eiwitten (AZ die niet in natuur voorkomen)
niet toxisch voor organisme + onafh. AZ-beschikbaarheid
Neg: duur, enkel kleine hoeveelheden
koppelingsefficiëntie per cyclus (1AZ) = 99% => enkel korte seq. (max. 50 AZ) 1%fout
→ oplossing: langer eiwit door koppelen 2 peptiden van 50AZ
↳neem N-protectie af van peptide1 en harsparel van peptide2 (vrije carboxy)
Toep: maken artificiële eiwitten, peptiden voor antistofproductie
Enzymatische synthese in vitro
In vitro translatie RNA in konijn reticulocyt lysaat (of terwekiem extract)
↳ gespecialiseerde TLN machinerie: ribosomen, AZ, E (+geen DNA)
Kan 1e in vitro TXN (DNA→RNA), daarna in vitro TLN (in 2 of 1 reacties)
Pos: snel, eenvoudig
Neg: kleine hoeveelheden
Toep: bepalen ORF (welke AUG van RNA is startcodon)
structurele en functionele studie (impact mutatie)
In vivo expressie systemen
!voor en nadelen organismes
Recombinante eiwitproductie:
1e recombinant DNA in plasmide kloneren => in organisme: TXN + TLN → recombinant eiwit
=> eiwit vrij door lyseren cellen/ secretie in medium
Gekozen organisme bepaalt expressie plasmide
Codon optimisatie:
Genetische code = gedegenereerd: synonieme codons => zelfde AZ
→ abundantie codon afh. organisme/celtype => keuze codon afh. #tRNAs voor codon aanwezig
Dus ∆DNA sequentie naar aanwezigheid tRNAs => ∆ snelheid TLN (<> gelijke eiwitsequentie)
→ Hogere eiwitexpressie als veel tRNAs voor dat codon aanwezig
Transiente eiwitproductie:
- Korte periode (dagen)
- dmv transfectie: geen integratie recombinant DNA in genoom organisme => DNA in cellen
verdunt
Stabiele eiwitproductie:
- Lange periode (maanden)
- dmv transductie: recombinantie DNA in genoom gastheer => blijft in dochtercellen aanwezig
Productie op laboratoriumschaal (1ml cryotube-1L fles) vs industriele schaal (opschalen tot max
1000L
↳ 1-10x106 cellen ↳ 300x109 cellen tank)
Isoleren van eiwitten
Homogenisatie dmv homogenisatiebuffer + verdere opzuivering (vaak)
Startmateriaal (staal) → ruw eiwitlysaat
Opbouw homogenisatiebuffer
• pH buffer bv Tris (pHbuffer = 7,5 = pHcel) <> bij bv. lysosoomale eiwitten zuurdere pH
→ pH bepaald Q => oplosbaarheid en activiteit eiwit
• Zout bv. NaCl
=> geen denaturatie + goed oplossen
• Proteasen inhibitor => geen afbraak eiwit
=> ≠ proteasen => bindt AZ/metaal in de katalytische site => inhibitie katalyse
=> tablet: mengsel meerdere protease inhibitoren
!met/zonder EDTA (als activiteit doel-eiwit beinvloed door EDTA bv. DNAsen)
o PMSF, BZA, aprotinine => serine proteasen bv.trypsine, thrombine, kaklikreine
o EDTA => Metalloproteasen
o Leupeptine => Cysteine proteasen (/thiol)
o Pepstatine => Aspartaat proteasen bv.pepsine, renine, cathepsine
• Event. Fosfatase inhibitor => geen defosforylatie
=> vaak mengsel meerdere
o NaFloride, NaPyrofosfaat, B-glycerofosfaat => Ser-/threonine fosfatasen
o NaOthovanadaat => Tyrosine fosfatasen
• Event. Detergent bv. NP40, Trition-X100, CHAPS,SDS
=> oplossen celmembraan, bij eiwitten die niet oplossen in H2O-opl.
• Event. Reducerend stof bv. DTT, 2-mercapto-ethanol
=> bregen SS-bruggen
Verdere opzuivering eiwitten
Chromatografie of elektroforese
Aanmaken van eiwitten
Doel
- Eiwit functie/structuur bestuderen, antistoffen zoeken tegen eiwit
- Eiwitmedicijn: antillichaam (tegen bepaald eiwit)/hormoon/enzym
- In waspoeder (lipasen,..) en voeding (enzymen,…)
Chemische synthese in vitro
Werking: synthese van C → N-terminus
1) Koppeling harsparel+peptidelinker aan carboxyterminus AZ
→ beschermingsgroep op N-terminus en zijketens AZ => bindt niet
2) Verwijder bescherming N-terminus
3) Koppeling C-terminus nieuw AZ (met protectie) aan N-terminus vorige
4) Repetitie
5) N en zijketen deprotectie + afklieven eiwit van hars en linker
=> °eiwit
, Pos: de novo synthese artificiële eiwitten (AZ die niet in natuur voorkomen)
niet toxisch voor organisme + onafh. AZ-beschikbaarheid
Neg: duur, enkel kleine hoeveelheden
koppelingsefficiëntie per cyclus (1AZ) = 99% => enkel korte seq. (max. 50 AZ) 1%fout
→ oplossing: langer eiwit door koppelen 2 peptiden van 50AZ
↳neem N-protectie af van peptide1 en harsparel van peptide2 (vrije carboxy)
Toep: maken artificiële eiwitten, peptiden voor antistofproductie
Enzymatische synthese in vitro
In vitro translatie RNA in konijn reticulocyt lysaat (of terwekiem extract)
↳ gespecialiseerde TLN machinerie: ribosomen, AZ, E (+geen DNA)
Kan 1e in vitro TXN (DNA→RNA), daarna in vitro TLN (in 2 of 1 reacties)
Pos: snel, eenvoudig
Neg: kleine hoeveelheden
Toep: bepalen ORF (welke AUG van RNA is startcodon)
structurele en functionele studie (impact mutatie)
In vivo expressie systemen
!voor en nadelen organismes
Recombinante eiwitproductie:
1e recombinant DNA in plasmide kloneren => in organisme: TXN + TLN → recombinant eiwit
=> eiwit vrij door lyseren cellen/ secretie in medium
Gekozen organisme bepaalt expressie plasmide
Codon optimisatie:
Genetische code = gedegenereerd: synonieme codons => zelfde AZ
→ abundantie codon afh. organisme/celtype => keuze codon afh. #tRNAs voor codon aanwezig
Dus ∆DNA sequentie naar aanwezigheid tRNAs => ∆ snelheid TLN (<> gelijke eiwitsequentie)
→ Hogere eiwitexpressie als veel tRNAs voor dat codon aanwezig
Transiente eiwitproductie:
- Korte periode (dagen)
- dmv transfectie: geen integratie recombinant DNA in genoom organisme => DNA in cellen
verdunt
Stabiele eiwitproductie:
- Lange periode (maanden)
- dmv transductie: recombinantie DNA in genoom gastheer => blijft in dochtercellen aanwezig
Productie op laboratoriumschaal (1ml cryotube-1L fles) vs industriele schaal (opschalen tot max
1000L
↳ 1-10x106 cellen ↳ 300x109 cellen tank)
