Alle leerdoelen van thema 1 zijn in dit document uitgebreid en overzichtelijk uitgewerkt. De leerdoelen bespreken de volgende onderwerpen:
- Antibioticaresistentie: bèta-lactamase-activiteit met western blot en elisa, plasmideconjugatie, remming bacteriegroei, rifampicine-resistentie
- Identific...
ALGEMEEN
Het kunnen oplossen van moleculaire rekensommen.
Het kunnen interpreteren van resultaten.
De juiste technieken bij een onderzoeksvraag kunnen kiezen.
Een onderzoeksvraag kunnen bedenken bij een set van technieken.
ANTIBIOTICARESISTENTIE
Bèta-lactamase-activiteit
Je kunt uitleggen hoe een SDS-PAGE en een Western Blot werken;
SDS-PAGE Western Blot
Manier om eiwitten te scheiden van Manier om gescheiden eiwitten vanuit een gel
het supernatant over te zetten op een membraan om de
aanwezigheid van een bepaald eiwit aan te tonen
door labeling met antilichamen
De kleinste eiwitten kunnen makkelijker door de Water: zorgt voor het juiste volume en
kleine poriën van de running gel migreren en concentratie
komen daardoor onderaan de gel terecht. De Methanol: zorgt voor een apolair milieu
grotere eiwitten blijven hoger achter in de gel Tris: pH buffer
Verdere analyse kan
door Coomassie Blue staining of WesternBlot
Er is een stacking gel die ervoor zorgt dat alle
eiwitten tegelijkertijd de gel inlopen en ze dus
evenveel looptijd hebben
Protocol SDS-page:
1. Ga naar het systeem en laad op elke gel 12µL van elk bacteriemonster
2. Laad op elke gel eveneens een laan met 10µL van de marker Pageruler prestained
3. Run de gel bij 200V tot het loopfront van de gel is afgelopen. Dit duurt ongeveer 30-45 minuten.
o Chloorionen laten los van de Tris moleculen waardoor het naar de negatieve pool migreert.
Precies de andere kant op als glycine, de eiwitten en Cl-ionen.
4. Snijd de SDS-page gels door. Ieder heeft nu twee identieke gels.
Protocol Western Blot:
1. Pak 1X blotbuffer (10X blotbuffer, methanol en water) en doe dit in een bakjes.
o In de blotbuffer zit water dat zorgt voor het juiste volume en concentratie; methanol dat
zorgt voor een gedeeltelijk apolair milieu en Tris als pH buffer
2. Bevochtig een westernblot spons met blotbuffer en leg deze op het zwarte deel van de sandwich
3. Bevochtig twee whatman papiertjes met blotbuffer en leg ze bovenop de spons
4. Leg daar een van de twee SDS-page gels op
5. Bevochtig het PVDF membraan met methanol en daarna met blotbuffer.
o Het PVDF membraan zit tussen 2 blauwe papiertjes om het membraan te beschermen tegen
eiwitten afkomstig van bijvoorbeeld vingers. Voor deze stap wordt alleen het witte
membraan gebruikt.
o Leg met membraan op de SDS gel
o Het membraan bindt aminozuren waardoor eiwitten geïmmobiliseerd worden op het
membraan waardoor de aanwezigheid aangetoond kan worden.
o Het bevochtigingen met methanol is omdat PVDF erg hydrofoob waardoor de blotbuffer
, niet opgenomen wordt. Door te weken in methanol kan de blotbuffer wel opgenomen
worden en kan transfer van eiwitten plaats vinden.
6. Bevochtig twee whatman papiertjes met blotbuffer
o Leg deze bovenop het PVDF membraan
7. Bevochtig een Western Blot spons met blotbuffer en leg ze op het whatman papier. Sluit af met
het rode deel van de casette.
8. Vul de gelbak gedeeltelijk met 1X blotbuffer.
o In elke gelbak passen twee blotsandwiches
9. Plaats het ice-pack
10. Plaats twee sandwiches: een van jullie zelf en een van het team waarmee je samenwerkt
11. Vul de bak verder met 1X blotbuffer en plaats de deksel
12. Blot overnacht bij 30V en 90mA.
Je kunt uitleg geven over de verschillende gebruikte stoffen voor de SDS-PAGE en Western Blot-
techniek, waarom je deze stoffen toevoegt en waarom op dat punt in het proces;
BETA-LACTAMASE AANWEZIGHEID: EIWIT ISOLATIE
Trichloorazijn (TCA) Wordt gebruikt voor het precipiteren, ofwel
neerslaan, van de eiwitten.
Aceton Wordt toegevoegd om TCA te verwijderen, want
dit is te zuur voor de buffer die een stap later in
het proces wordt toegevoegd.
Tris Base Tris Base verhoogt de pH.
Laemmli sample 0.5M Tris/HCl pH 6.8 Tris/HCl werkt als een buffer. Glycine zal bij pH
buffer (LSB) van 6.8 in de vorm van een zwitterion
voorkomen. Door het potentiaalverschil zal
glycine van de buffer de stacking gel in bewegen.
De stacking gel bevat dezelfde pH als LSB.
10% (w/v) SDS SDS is een zeep dat eiwitten denatureert.
10% Glycerol Glycerol zorgt voor het verhogen van de dichtheid
waardoor het mengsel makkelijker in de slotjes
blijft zitten.
14 M 2- Dit zorgt voor het verbreken van de
mercatoethanol zwavelbruggen (door protonen te doneren aan S
die de zwavelbrug vormt) waarmee de eiwitten
denatureren. Dit werkt samen met SDS om de
eiwitten alleen op gewicht te scheiden.
0.4% Dit kleurt geel bij een lage pH van <3. De pellet
broomfenolblauw samen met LSB geeft een gele kleur. Het
toevoegen van tris-HCl verhoogt de pH waarmee
de kleur blauw wordt. Het heeft een vergelijkbare
werking als Orange G.
BETA-LACTAMASE AANWEZIGHEID: SDS-PAGE
Running gel Demiwater Zorgt voor het verkrijgen van de juiste
concentratie.
(Bis)acryclamide 40% De concentratie is hoger dan in de stacking gel.
Deze stof zorgt ervoor dat de scheiding plaats
vindt op basis van gewicht.
Tris-HCL pH 8.8 Glycine verandert hierdoor in een protondonor.
De lading van glycine wordt negatief waardoor
het sneller door de gel beweegt.
SDS 10% Doordat de acrylamide concentratie hier hoger is,
, ondervinden de SDS-gebonden eiwitten meer
weerstand.
Ammoniumpersulfaat Het radicaliseert (bis)acrylamide wat de
polymerisatie helpt
TEMED Stimuleert de productie van vrije radicalen door
APS en daarmee dus indirect de polymerisatie van
acrylamide.
Stacking gel Demiwater Zorgt voor het verkrijgen van de juiste
concentratie.
(Bis)acrylamide 40% De concentratie is lager en bevat dus grotere
poriën. De grote en kleine eiwitten worden
geconcentreerd zodat ze tegelijkertijd de running
gel in migreren.
Tris/HCL pH 6.8 Glycine is soms negatief (want het isoelektrisch
punt van 6 is nog niet bereikt). Glycine beweegt
hierdoor langzaam door de stacking gel heen naar
de pluspool. Cl- ionen bewegen door de grootte
en lading sneller door de gel naar de positieve
pool waardoor er lokaal een hoge concentratie
tris ionen ontstaat die naar de minpool migreert.
Hierdoor wordt de migratie van clionen
verhindert. Glycine moet daarom nog sneller
waardoor de eiwitten op elkaar gedrukt worden
SDS 10% De SDS gebonden eiwitten zijn sneller gemigreerd
dan glycine. Er is een front met een leidend front
van cl-, een interfase van SDS-gebonden eiwitten
en een opvolgend front van glycine.
Ammoniumpersulfaat Het radicaliseert (bis)acrylamide wat de
polymerisatie helpt
TEMED Stimuleert de productie van vrije radicalen door
APS en daarmee dus indirect de polymerisatie van
acrylamide.
TGS Tris Zorgt voor de aanvoer van Cl- in de gel die richting
de pluspool bewegen.
Glycine Glycine is negatief geladen. Door het
potentiaalverschil beweegt glycine de stacking gel
in. In de stacking gel is de PH lager (6.8),
waardoor glycine van lading verandert.
SDS 0.1% Zorgt ervoor dat DS- aangevoerd blijft in de gel.
Het beweegt richting de pluspool. Als SDS loslaat
van de eiwitten is er een overmaat aanwezig om
weer te binden. SDS zorgt ervoor dat alle eiwitten
unaniem negatief geladen zijn.
Pageruler prestained plus Geeft de DNA ladder aan zodat de grootte van de
fragmenten kan worden bepaald.
BETA-LACTAMASE AANWEZIGHEID: WESTERN BLOT & EIWITDETECTIE
Blotbuffer Water Om de juiste concentratie en volume te
verkrijgen.
Methanol Zorgt voor een gedeeltelijk apolair milieu.
Tris Buffert.
Glycine Creëert een soortgelijk milieu als bij SDS-PAGE.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller fleurheling. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.95. You're not tied to anything after your purchase.
