Onderzoekmethoden Thema 3 Proteomics en massaspectrometrie
7 views 0 purchase
Course
Onderzoeksmethoden
Institution
Universiteit Utrecht (UU)
Hoorcolleges en werkcolleges gegeven gedurende thema 3 bij het onderwerp 'Proteomics en massaspectrometrie' zijn uitgebreid en overzichtelijk uitgewerkt in dit document. Het gaat dus om de volgende onderdelen: HC HPLC en scheiding van peptiden vis SCX en RP, HC massaspectrometrie, HC proteomics, H...
PROTEOMICS EN MASSASPECTROMETRIE
HPLC EN SCHEIDING VAN PEPTIDEN VIA SCX EN RP
Basisprincipe van HPLC
• High performance/presure liquid chromatography
• Basisopstelling HPLC:
1. Mengkamer + pompen (Boven op de kast zitten twee buffervaten: buffer A en
buffer B)
2. Injectionvalve
3. Monsters (bv. 96-wellsplaat)
4. Kolom
5. Detector: detecteren peptiden door UV signaal te meten, 280 nm
6. Computer voor aansturing
• Buffer A en buffer B zorgen voor een gradiënt elutie -> peptides komen
in porties van de kolom af.
• De gradient elutie werkt via een injection valve: een rond ding met meerdere openingen die op
verschillende manieren verbonden kunnen worden.
• Stappen werking injection valve:
1. Monsters opbrengen
2. Kraan draaien: Peptiden
binden aan kolom
3. Volgens schema wisselen van
buffer A naar B
4. Sample wordt gescheiden op
de 96-wells plaat
Principe van scheiding via SCX
• Strong cation exchange
• Kolommateriaal dat peptiden
bindt op basis van hun lading
• Dragermateriaal van kolom bevat negatieve ladingen.
• Buffer A bevat 25 mM NaCl, 0,1% mierenzuur, pH = 3. Bij deze pH zijn alle peptiden
positief geladen: kleine peptiden (+), middel peptiden (++), grotere peptiden (+++).
→ Hoeveelheid + is afhankelijk van de samenstelling van aminozuren, niet de grote
van de peptiden.
• Buffer B bevat 300 mM NaCl, 0,1% mierenzuur, pH = 3.
o Na+ verdringt de binding tussen de kolom en de peptiden, meer Na+ is meer
verdringing
o Grotere peptides vereisen meer Na+ om de binding op te heffen
o Eerste piek -> +
o Tweede piek -> ++
o Derde piek -> +++
• In totaal worden er 40 fracties opgevangen.
→ De peptiden van het complexe monster zijn nu gescheiden op
basis van hun lading.
Principe van scheiding via RP
• Reversed phase liquid chromatography
• Het dragermateriaal bevat lange koolstofketens: C18-kolom
• Buffer A: 0,1% mierenzuur
, • Buffer B: 0,1% mierenzuur, 50% acetonitril (heel hydrofoob)
• C18 kolom is heel hydrofoob
• Peptiden zijn voor een groot deel hydrofoob, deze zullen binden aan
het dragermateriaal.
• Na+ en Cl- komen als eerst de kolom uit, deze hebben geen affiniteit
voor C18 ketens -> ontzouten monsters
• Hydrofobe gedeeltes binden aan de kolom:
o Relatief hydrofiele peptide heeft minder
acetonitril nodig om eraf te komen, hydrofoob
meer
o Dus eerste piek = hydrofiel en tweede piek =
hydrofoob
• Vanuit de kolom gaan de peptiden direct naar de MS
→ Je hebt de peptiden gescheiden op basis van
hydrofiel/hydrofobiteit
MASSASPECTROMETRIE
Basis MS
• Ionen in gasfase
o Vacuüm is heel belangrijk voor een MS
- ‘Pure’ peptide massa’s meten
- Geen interactie met moleculen uit de lucht (N2,
O2, CO2)
o Peptide-ionen gaan vanuit vloeistof naar gasfase =
electrospray ionisatie (ESI)
→ Peptide ion MOET in gasfase en in vacuüm zijn om gemeten te worden
• Massa analyse
o Analyse van de peptide massa’s -> meten van m/z
o Voorbeeld: massa peptide = 1000 Da
1xH+ aan peptide gebonden; lading peptide 1*; m/z = (1000+1)/1=1001
2xH+ aan peptide gebonden; lading peptide 2*; m/z = (1000+2)/2=501
• Ionen detector
o Ionen raken detector -> gegevens worden opgeslagen in de computer: m/z en hoeveelheid
ionen van éen soort
o Voorbeeld: de volgende aantallen pepides hebben de detector geraakt:
500.000x m/z 600; 20.000x m/z 800; 200.000x m/z 950
Electrospary ionisatie (ESI): ionisatie van peptide ionen
• Kenmerken peptiden
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller fleurheling. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.35. You're not tied to anything after your purchase.
