Samenvatting Enzymkinetiek en enzymmechanismen (Prof. Dr. ir. Wim Versees)
56 views 1 purchase
Course
Enzymkinetiek en enzymmechanismen
Institution
Vrije Universiteit Brussel (VUB)
Hoofdstuk 2-7 Enzymkinetiek en enzymmechanismen gegeven door Prof. D. Wim Versees. Interessant vakje! Ondanks dat dit documentje veel komma's bevat, kan het je een grote onderscheiding opleveren. Succes xoxo
Chapter 2 – Steady-State Enzyme Kinetics
Inhoud:
2.1. Historical perspective
2.2. The Michaelis Menten (MM) equation
2.2.1. The equilibrium assumption (MM treatment)
2.2.2. The steady state assumption (Briggs-Haldane treatment)
2.2.3. Intermediates occurring after EA (minimal realistic model)
2.3. Significance of MM parameters
2.4. Graphs of the MM equation
2.4.1. Plotting v in function of a
2.4.2. Lineweaver Burk
2.4.3. Hanes plot
2.4.4. Eady-Hofstee plot
2.4.5. Cornish-Bowden plot
2.5. Experimental design
2.6. The integrated MM equation
2.7. Reversible reactions – Haldane relationship
2.8. Derivation of rate equations
2.8.1. Method of net rate constants and transit times
2.8.2. Method of King and Altman
2.1. Historical perspective
De snelheden v enzyme-gekatalyseerde reacties werden voor het eerst bestudeerd eind 19e eeuw. Op
dat moment wisten ze nog niet dat een enzym een eiwit was aldus was hun manier v werken primitief
en buffers waren op dat moment nog niet bekend, aldus werd er geen pH gecontrolleerd (concept pH
ontstond pas in 1909).
Meeste vdeze vroege studies werkten op enzymen afkomstig v fermentatieprocessen (openbreken v
gistcellen(cellysaten) – cytoplasma werd toegevoegd aan bepaald substraat en mn keek wat er
gebeurde.
In 1890 werkten O’Sullivan en Thompson op invertase (sucrose + water => glucose + fructose). Wat
hadden ze gezien?
- Hoe meer enzym, hoe sneller de reactie
- Hoe hoger sucrose conc, hoe sneller de reactie (ze zagen een rechte met lichte deviaties)
We wisten al lang dat A + B ® C met een v = k.A.B en als je v plot in functie v A of B dan zou
je een lineaire rechte krijgen.
Ze dachten dus ook dat ze op dezelfde manier voor E + S ® P een v gingen krijgen = k.E.P,
namelijk een rechte, echter kwam dit overeen met wat ze zagen, namelijk een lineaire rechte.
- Reactie gebeurde bij optimale T en mn zag dat Toptimaal verschoof naarmate je S toevoegt, ttz
in de aanwezigheid v S zal invertase een T verdragen dat 25°C hoger ligt dan in de afwezigheid
v S => er w dus iets gestabiliseerd (nu weten we dat dat je S is dat bindt op je enzym).
Een paar jaar later zag Brown echter wel duidelijke deviaties indien v uitgezet werd in functie v S, ttz
bij hogere concentratie v S zag mn een afbuiging vd lineariteit en zagen ze dat de snelheid
onafhankelijk werd van S.
Op dat moment wisten ze dat ze voor enzymen op zoek moesten gaan naar een ander
werkingsmechanisme.
1
,Vervolgens had je Henri die als eerste een mechanisme had voorgeschoteld waarbij E en S moesten
binden ter vorming van product en ook kwam hij tt de juiste snelheidsvgl.
Volk was nog niet rijp genoeg + Henri had wat pech met zijn metingen aangezien hij zijn metingen niet
kon uitvoeren bij stabiele pH aangezien dat nog niet ontdekt was + hij werkte niet met initial rate
methode => ttz Henri kreeg zijn eer niet omdat zijn data dus niet zo convincing was om zijn hypothese
te ondersteunen.
10 jaar later kwamen Michaelis en Menten op de markt. Ze hebben Henri zijn exp uitgevoerd bij
constante pH en initial rate condities => kwamen op dezelfde conclusie als Henri.
Nu moeten we snelheidsvgl’n afleiden voor dit mechanisme:
2.2. The MM equation
2.2.1. The equilibrium assumption: MM treatment
Ter herinnering:
- k2 en k-1 => 1e orde snelheidsconstante (1/s)
- k1 => 2e orde snelheidsconstante (1/Ms)
We hebben dus snelheidsvgl maar we kennen x niet (conc intermediair).
We schrijven dus x ifv tijd.
Stelsel v 2 vergelijkingen => geen analytische oplossing (wel numeriek maar dat bestond op dat
moment niet, bovendien iedereen houdt wel van een analytische oplossing waarop je een curve kan
fitten right). Dus om hieraan te voldoen ging men vereenvoudigingen maken:
2
,Door k2<<<k-1 te veronderstellen kan je de 2 stappen ontkoppelen van elkaar, maw heel snel EA
vormen en af en toe krijg je dissociatie van E en P. Je kan dus eerste stap als een klassieke bindingsstap
beschouwen en thus een dissociatiebindingsconstante definiëren (Ks – Kd vh substraat).
Vervolgens kunnen we de massabalans bepalen waar we e0 = e + x (totale conc v enzym is conc v vrij
enzym + conc v enzym gebonden met substraat). Hierdoor krijg je een uitdrukking voor x en deze dan
vervolgens invullen in de effectieve snelheidsvergelijking. We krijgen een snelheidsvergelijking in
functie van a en e (waar we ook naar opzoek waren).
Al een jaar later deden Slyke en Cullen studies op urease (ipv invertase) en stelden ze volgende
mechanisme voor:
We zien dus dat dit vdezelfde vorm is als MM met verschil dat je microscopische parameters hebt.
Dus dit waren de modellen die toen ontwikkeld waren en je ziet dus een r.e. verband tussen v en e,
maar je ziet dat a zowel in teller als noemer staat waardoor je geen rechte maar hyperbool verkrijgt.
2.2.2. The steady state assumption: Briggs-Haldane treatment
Naast de equilibrium assumption van MM heb je ook de steady
state assumption van Briggs-Haldane. Briggs en Haldane
onderzoekten een meer algemeen mechanismen waarbij geen
assumpties werden gemaakt over k-1 en k2. Als je in condities
werkt waarbij substraatconc >>> enzymconcentratie, dat
steady state bereikt wordt (concentratie van intermediair is
constant omdat er evenveel product gevormd wordt als
substraat verbruikt wordt.).
Besef wel dat evenwicht ≠ steady-state! Verschil?
Evenwicht? Evensnel v A naar B als omgekeerd.
Steady state? Evensnel v A naar B als v B naar C gaat. Je krijgt
in het begin opbouw v B maar op bepaald moment gebeurt de
synthese en afbraak even snel.
3
, Dus eerst heb je een pre-steady state fase waarbij je opbouw krijgt van EA complex. Na enige tijd
zullen de concentraties van alle enzymspecies constant blijven tot substraat gedepleteerd w (steady-
state conditie).
SS condities zorgen ervoor dat de differentiaalvergelijkingen omgezet kunnen worden naar klassieke
vergelijkingen.
Teller en N delen door k1 en dan krijg je
algemene vorm zoals MM voorstelde.
k-1 en k2 zijn beide eerste orde snelhconst
dus die mag je optellen. Dus als je ooit
vergeet welke k's weer vanboven staan,
het zijn de eerste orde ones.
Door wat samen te nemen krijg je de
klassieke MM vergelijking. Invulling v kcat
en KM is enkel geldig voor dit mech. Zodra
mech complexer w, zal de algemene
uitdrukking nog steeds gelden, maar die
laatste vgl niet. Maw Km en kcat w
complexer naarmate mechanisme
complexer w. M in eer v MM btw
Ok hoe stellen we zo een curve op id praktijk?
Voor aantal S conc, meet mn systeem => deze aantal punten kunnen we fitten op MM equation.
Probleem? E en S mengen? S w direct verbruikt! Je wil bv exp doen bij 1 M S => op moment dat je E
toevoegt, dan verdwijnt S (vervelend want je wil de S concentratie constant houden). Omwille v deze
reden gaan we werken onder initial rates condities.
We zien hoeveelheid product gevormd ifv tijd. Indien v constant is zou mn een rechte verkrijgen (v =
dp/dt). In realiteit krijg je dus geen rechte omwille dat S verbruikt w en snelheid thus gaat dalen (want
hoe kleiner S, hoe trager de reactie).
Dus E+S? dan meet je productvorming ifv tijd en dan moet je de rico nemen v die curve en deze
extrapoleren naar 0 omdat dat het punt is waar S conc het hoogst is (en thus niet verbruikt is)
S = S0 (of a = a0) en dus kan MM vergelijking anders genoteerd w:
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller sarahvanvolsem. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $20.49. You're not tied to anything after your purchase.
