Exam (elaborations)
Gentechnologie I: Uitgewerkte examenvragen
- Course
- Institution
Voorgaande & veelvoorkomende vragen, volledig uitgewerkt aan de hand van cursus & slides
[Show more]
Seller
Follow
NVbiochem
Content preview
Gentechnologie I2e bachelor Biochemie-Biotechnologie
Uitgewerkte vragen (theorie + wc)
, De Veylder
Open vragen
Bespreek zinkvinger endonuclease
Deze nucleasen zijn hybride moleculen opgebouwd uit een polymeer zink vinger domein
specifiek voor een welbepaalde DNA herkenningssequentie, gekoppeld aan een FokI
endonuclease domein.
FokI restrictie-enzym functioneert als een dimeer eiwit
→ 2 heterodimere zink vinger nucleasen worden aangemaakt voor de volledige verknipping
van dsDNA
→ herkenning door aanwezigheid van zink vinger structuren (zie figuur)
→ DNA herkenning van beide hybride nucleasen
→ FokI domein van beide hybride resulteert in dimerisatie van FokI
→ verknipping van het DNA
Bespreek gradiëntszuivering
,Gelelektroforese + uitleggen welke techniek je bij een fragment van 50 tot 200 kb zou
gebruiken
Bij 50-200kb → Pulsed Field Gelelektroforese
→ Fragmenten boven 50 kb kunnen niet door poriën dus lopen langs de gel (als reptiel)
Bij elke verandering in stroomshock moeten de fragmenten zich wenden
- Grote fragmenten → moeilijker wendbaar
(2x) Bespreek 2 mogelijkheden om willekeurige mutaties aan te brengen en om
plaatsspecifieke mutaties aan te brengen.
Willekeurige mutagenese kan via
- Mutatorstam
- Straling
- Chemische mutagenese
De 2 mogelijkheden voor plaatsspecifieke mutaties zijn de volgende:
1. Als er een unieke knipplaats is in het gekloneerd DNA ter hoogte van de plaats waar een
mutatie bestudeerd moet worden, kan hier geknipt worden.
→ Bij toevoeging exonuclease → deletie
→ Er kan ook een synthetisch oligo worden toegevoegd in plaats van een exonuclease →
frameshift
Het probleem hier is dat er een unieke restrictieplaats moet aanwezig zijn
2. Toevoegen oligonucleotide-primer → plaatsspecifieke mutagenese → primer zal met
het DNA annealen, dat enkelstrengig werd gemaakt na denaturatie door hittebehandeling.
, → Dit kan ook zonder perfecte complementariteit in de juiste condities
Na de aanhechting van de mutagenese-primer & 1e replicatie-ronde → parentale
plasmidestreng draagt methylatie.
Deze streng kan geknipt worden door methylatie-specifieke restrictie-enzymen (Dpn1),
terwijl de ongemethyleerde strengen ongedeerd blijven en zullen vermenigvuldigen, dan
→ inverse PCR: primers gaan van elkaar wegkijken ipv naar elkaar toe.
Waar de ene primer dan stopt gaat de andere starten zodat de hele vector kan worden
geamplificeerd.
Als er dan een mutatie in één van de 2 primers aanwezig is, wordt een specifieke mutatie
geïntroduceerd.
Ligatie van de vector: werkt alleen bij aanwezigheid van
→ ATP
→ 5’ fosfaat
De gemethyleerde parentale streng kan verwijderd worden door behandeling met Dpn1.
De willekeurige mutaties kunnen als volgt worden geïntroduceerd:
1. Gebruik van mutatorstam
= stam waarin willekeurige mutagenese kan worden bekomen bij het binnenbrengen van
een gen.
→ Zo een stam kan deficiënt zijn in stappen van de DNA repair machinerie (mutS, mutD,
mutT) → zorgt voor hogere mutatiefrequentie dan in WT stammen
De vector wordt in de mutatorstam gebracht.
Tijdens replicatie van de vector gaan er veel fouten worden ingebouwd. Het genetisch
materiaal wordt geïsoleerd en gesequeneerd.
→ eenvoudig & goedkoop om een groot aantal random puntmutaties in te brengen in een
gen van interesse
→ Nadeel: kolonies groeien traag, de aspecifieke mutaties kunnen ook plaatsvinden in een
gen dat we helemaal niet willen onderzoeken
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller NVbiochem. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $9.25. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
62890 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now