The aim of this report is apply the Polymerase Chain Reaction (PCR) of an bacterian DNA. It's explained basic information of the tecnic, also the process and results of the experimentation.
Escuela superior politécnica del litoral Fc
v
Facultad de ciencias de la vida
Biología Celular y Molecular
LABORATORIO PRÁCTICO
Facultad de
ciencias de la
vida
CÓDIGO
NOMBRE Analía Paulina Rodríguez Díaz BIOG1021
PROFESOR Eduardo Sánchez Timm
LABORATORIO Microbiología y técnicas moleculares
FECHA 14/Enero/2023 PARALELO 104
TEMA DE LA PRÁCTICA 4 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
OBJETIVOS:
OBJETIVO GENERAL:
Comprender los principios básicos de la técnica Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
utilizando muestras de ADN bacteriano y cebadores que amplifican genes que se encuentran en
ellos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
-Explicar la acción de los primers dentro de las muestras usadas para la reacción de cadena de
polimerasa para conocer la importancia en la efectividad de la PCR.
-Aplicar la visualización de las muestras de la reacción en cadena de polimerasa por medio de la
electroforesis en gel de agarosa.
INTRODUCCIÓN:
Se conoce a la reacción en cadena de la polimerasa o PCR a la reacción de enzimas in vitro que va a
permitir la amplificación de una secuencia determinada de ADN por medio de ciclos repetidos en
donde se realizará la copia de la secuencia. Para llevar a cabo la reacción en cadena de polimerasa
se necesita del ADN, el cual corresponde una cadena doble que se separará los puentes de
hidrógeno y así se usará un templado para que la enzima Taq ADN polimerasa sintetice o complete
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las cadenas. La ventaja de esta enzima es que proviene de la bacteria termófila denominada
Thermus aquaticus que puede vivir a temperaturas muy elevadas.
Además, se requiere usar primers, secuencias de oligonucleótidos que precisa la secuencia a
amplificar. Existe la secuencia llamada “forward” y “reward” que se mezclaran con la cadena
molde y estas cadenas puedan ser extendidas por la enzima en dirección 5´a 3´. También se pueden
utilizar dNTP´s que son las bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa formará las nuevas
cadenas de ADN. El buffer constituirá la solución amortiguadora que, en la mayoría de los casos, se
encuentra compuesta de Tris-HCL a un pH de 8. Al buffer se le agrega magnesio, el cual es un
cofactor enzimático que tendrá impacto en la especificidad de la PCR, pero se debe considerar su
concentración para que no inhiba el rendimiento de la Taq polimerasa, en algunas soluciones
amortiguadoras ya viene incorporado. Por último, el agua funciona como disolvente en la reacción.
En cada ciclo de la PCR ocurren tres fases principales: desnaturalización, anillamiento o hibridación
y extensión. En la primera etapa, es donde sucederá el rompimiento de las cadenas del ácido
desoxirribonucleico que se usarán como molde. Aquí, las cadenas son calentadas y separadas a una
temperatura de 95°C, pero depende del apareamiento de bases, ya que a más cantidad de G-C se
necesita más tiempo para romper los tres enlaces. En la hibridación, los primers se ubicarán en el
extremo 3´del molde y se anillarán con su secuencia complementaria a una temperatura entre 50-
60°C. Finalmente, en la extensión, la Taq polimerasa va agregando los dNTP´s para completar las
cadenas de ADN siendo la temperatura optima, 72°C (Ibarra et al., 2013).
Para la práctica de laboratorio, se empleó el Taq polimerasa máster mix (FastGene Taq 2x Ready
Mix) que contiene justamente los componentes descritos anteriormente con la excepción de que se
le añade cloruro de magnesio, un loading dye (por lo que cuando se lo incorpore en el gel de
agarosa, ya no será necesario agregarle) y estabilizadores. Asimismo, el ADN usado fue bacteriano
que creció en contaminación de plantas in vitro de mortiño y los primers 16s. La marca del máster
mix es Nippon Genetics Europe, Cat. No. LS27. Luego, se aplicó el programa MiniPCR, en donde
se determinó el tiempo para cada fase de la reacción, siendo la desnaturalización (40 segundos), el
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