TD N° 1. PREPARATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE
Exercice 1 :
La caractérisation de l’enzyme de glucokinase chez le poulet a nécessité son extraction à
partir de foie, selon le protocole suivant :
- Un prélèvement de 500 mg de foie a été homogénéisé dans la glace dans 3 ml de solution de
lyse composée de NaCl à 150 mM, d’un tampon Tris-HCl à 10 mM (pH 7,4), d’EDTA à 1
mM, de Triton X-100 à 1% (m/v) et de PMSF à 0,5 mM.
- L’homogénat a été centrifugé à 1000 g pendant 3min à 4°C, et le surnageant a été de nouveau
soumis a l’ultracentrifugation à 150 000 g pendant 45 min à 4°C. Le surnageant a été conservé à -
80°C.
1a. Donner le rôle de chaque substance chimique composant la solution de lyse.
1b. Peut-on remplacer le Triton X-100 par le dodécylsulfate de sodium (SDS) ? Justifier
1c. Proposer une technique d’homogénéisation.
1d. Quelle méthode de centrifugation a été employée pour séparer l’enzyme? Connaissez-vous
une autre méthode ?
1e. Quelle méthode de conservation a été employée ? Connaissez-vous une autre méthode ?
Exercice 2 :
Le fractionnement subcellulaire d'hépatocytes a permis de rechercher dans quelle fraction, la
β-glycérophosphatase est principalement localisée. Après homogénéisation et centrifugation
différentielle, la distribution de l'enzyme est la suivante :
Fraction Volume (ml) Dilution Absorption Activité Activi
en U.A té en
%
Homogénat 120 1/30 0,50
Noyaux 30 1/20 0,22
Mitochondries 20 1/100 0,22
Lysoosomes 16 1/100 0,34
Microsomes 20 1/25 0,44
Surangeant 290 1/20 0,04
2a. Donner le principe de la centrifugation différentielle.
2b. Pourquoi tous les composants cellulaires ne sont pas tous retrouvés dans le premier culot ?
2c. Le fractionnement a été réalisé en présence d’un tampon. Quel est son rôle? Lequel faut-il
choisir ?
2d. Proposez une solution de lyse ?
2e. Connaissez-vous une autre méthode pour séparer les organites cellulaires par centrifugation ?
Expliquez son principe.
2f. Calculer l'activité totale de chaque fraction ainsi que le pourcentage d'activité. Dans quelle
fraction se localise l’enzyme ?
Exercice 3 :
Un groupe de chercheur s’intéresse à l’isolement et la purification des cellulases produites par
des bactéries appartenant à l’espèce de Bacillus subtilis. Un ensemble de 20 isolats ont été prélevés
à partir d’une rizière.
1
, 4a. Donner un protocole permettant le prélèvement des bactéries à partir du sol.
4b. Proposer une démarche expérimentale permettant de sélectionner une souche productrice de
cellulases.
4c. Faut –il prévoir une extraction de l’enzyme par la lyse cellulaire ? Si oui quelle
technique recommandez-vous ?
4d. Donner un titre au graphique suivant et commenter le.
4e A quelle longueur d’onde, le suivi d’absorption des protéines a été réalisé ? Justifier ?
4f. Déterminer à quelle concentration de NaCl l’enzyme est éluée.
4g. Connaissez-vous une autre méthode d’élution ? Quelles sont les précautions à prendre ?
Exercice 4 :
Un groupe de chercheurs s’intéresse à l’isolement et la purification d’une enzyme de lipase
thermostable pour une application industrielle en agroalimentaire. Dix isolats de champignons
filamenteux (moisissures) appartenant au genre Talaromyces ont été isolés à partir du sol d’une
station thermique. La récupération de l’enzyme a été faite par centrifugation à 3500 tpm pendant 15
minutes. L’extraction a été réalisée en présence d’un tampon.
La lipase est une enzyme extracellulaire spécialisée dans la transformation de triglycéride en
glycérol et en acides gras (figure 1). La libération des acides gras est accompagnée d’une
diminution du pH de milieu de culture. Cette diminution peut être mise en évidence par la présence
du rouge de phénol (coloration rouge pour la forme basique et jaune pour la forme acide).
Figure 1 : Réaction d’hydrolyse d’un triglycéride catalysée par la lipase en milieu aqueux
4a. Proposer une technique d’isolement d’un champignon filamenteux à partir du sol.
4b. Proposer un protocole expérimental permettant de mettre en évidence la capacité lipolytique
des isolats. Le pH du milieu gélosé est de 7 et la température optimale d’incubation est de
30°C.
4c. Exprimer la vitesse de centrifugation en nombre de g, sachant que le rayon de la centrifugeuse
est de 10 cm ?
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Exercice 1 :
La caractérisation de l’enzyme de glucokinase chez le poulet a nécessité son extraction à
partir de foie, selon le protocole suivant :
- Un prélèvement de 500 mg de foie a été homogénéisé dans la glace dans 3 ml de solution de
lyse composée de NaCl à 150 mM, d’un tampon Tris-HCl à 10 mM (pH 7,4), d’EDTA à 1
mM, de Triton X-100 à 1% (m/v) et de PMSF à 0,5 mM.
- L’homogénat a été centrifugé à 1000 g pendant 3min à 4°C, et le surnageant a été de nouveau
soumis a l’ultracentrifugation à 150 000 g pendant 45 min à 4°C. Le surnageant a été conservé à -
80°C.
1a. Donner le rôle de chaque substance chimique composant la solution de lyse.
1b. Peut-on remplacer le Triton X-100 par le dodécylsulfate de sodium (SDS) ? Justifier
1c. Proposer une technique d’homogénéisation.
1d. Quelle méthode de centrifugation a été employée pour séparer l’enzyme? Connaissez-vous
une autre méthode ?
1e. Quelle méthode de conservation a été employée ? Connaissez-vous une autre méthode ?
Exercice 2 :
Le fractionnement subcellulaire d'hépatocytes a permis de rechercher dans quelle fraction, la
β-glycérophosphatase est principalement localisée. Après homogénéisation et centrifugation
différentielle, la distribution de l'enzyme est la suivante :
Fraction Volume (ml) Dilution Absorption Activité Activi
en U.A té en
%
Homogénat 120 1/30 0,50
Noyaux 30 1/20 0,22
Mitochondries 20 1/100 0,22
Lysoosomes 16 1/100 0,34
Microsomes 20 1/25 0,44
Surangeant 290 1/20 0,04
2a. Donner le principe de la centrifugation différentielle.
2b. Pourquoi tous les composants cellulaires ne sont pas tous retrouvés dans le premier culot ?
2c. Le fractionnement a été réalisé en présence d’un tampon. Quel est son rôle? Lequel faut-il
choisir ?
2d. Proposez une solution de lyse ?
2e. Connaissez-vous une autre méthode pour séparer les organites cellulaires par centrifugation ?
Expliquez son principe.
2f. Calculer l'activité totale de chaque fraction ainsi que le pourcentage d'activité. Dans quelle
fraction se localise l’enzyme ?
Exercice 3 :
Un groupe de chercheur s’intéresse à l’isolement et la purification des cellulases produites par
des bactéries appartenant à l’espèce de Bacillus subtilis. Un ensemble de 20 isolats ont été prélevés
à partir d’une rizière.
1
, 4a. Donner un protocole permettant le prélèvement des bactéries à partir du sol.
4b. Proposer une démarche expérimentale permettant de sélectionner une souche productrice de
cellulases.
4c. Faut –il prévoir une extraction de l’enzyme par la lyse cellulaire ? Si oui quelle
technique recommandez-vous ?
4d. Donner un titre au graphique suivant et commenter le.
4e A quelle longueur d’onde, le suivi d’absorption des protéines a été réalisé ? Justifier ?
4f. Déterminer à quelle concentration de NaCl l’enzyme est éluée.
4g. Connaissez-vous une autre méthode d’élution ? Quelles sont les précautions à prendre ?
Exercice 4 :
Un groupe de chercheurs s’intéresse à l’isolement et la purification d’une enzyme de lipase
thermostable pour une application industrielle en agroalimentaire. Dix isolats de champignons
filamenteux (moisissures) appartenant au genre Talaromyces ont été isolés à partir du sol d’une
station thermique. La récupération de l’enzyme a été faite par centrifugation à 3500 tpm pendant 15
minutes. L’extraction a été réalisée en présence d’un tampon.
La lipase est une enzyme extracellulaire spécialisée dans la transformation de triglycéride en
glycérol et en acides gras (figure 1). La libération des acides gras est accompagnée d’une
diminution du pH de milieu de culture. Cette diminution peut être mise en évidence par la présence
du rouge de phénol (coloration rouge pour la forme basique et jaune pour la forme acide).
Figure 1 : Réaction d’hydrolyse d’un triglycéride catalysée par la lipase en milieu aqueux
4a. Proposer une technique d’isolement d’un champignon filamenteux à partir du sol.
4b. Proposer un protocole expérimental permettant de mettre en évidence la capacité lipolytique
des isolats. Le pH du milieu gélosé est de 7 et la température optimale d’incubation est de
30°C.
4c. Exprimer la vitesse de centrifugation en nombre de g, sachant que le rayon de la centrifugeuse
est de 10 cm ?
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