Samenvatting van partim cytologie van cel II. Jaar (prof. Van Hengel). Bevat alles wat in de lessen is gezegd wat op de ppt (haar cursus) staat. 26 bladzijden, vaak verduidelijking met een figuur. Voor het examen leer ik alleen nog maar dit. Succes!
Answer: verhogen vd densiteitsverschillen dmv zware metalen, bij EM
- uranylacetaat
- loodcitraat
- Os04 (osmiumtetroxide)
2.
Geef 4 soorten specifieke kleurtechnieken, wat kleuren ze en geef extra uitleg?
Answer: 1) Indifferente kleurstoffen --> vetten aankleuren bv. red oil
2) Immunohistochemische kleuring --> met antilichamen
a) Immunocytochemische kleuring --> cel kleuren met Ig (bv. met DAB)
b) Immuno- goud kleuring (EM) --> aan Ig hang je goudpartikel
c) Immunofluorescentie (LM) --> aan Ig hang je een fluorochroom, direct/indirect en
Toepassing:CTFR lokaliseren, is gemuteerd bij muco --> minder CFTR en niet meer apicaal bij muco patiënten.
Answer: oculair, objectief en condensor (hiermee richt je lichtbundel op weefsel)
Max 1000x vergoot: oculair (10x) objectief (4x, 10x,40x,100x)
5.
Wat is er zo speciaal aan fluorescentie microscoop? Leg uit geef vb
Answer: Andere opstelling: emissie- en excitatiefilter
Je grbuikt licht ve bepaalde golflengte= excitatielicht via filters , vervolgens wordt fluorochroom aangeslagen, licht komt uit materiaal= emissielicht
bv. alexa 488 (abs 488,em519)
Liefst aanslaan met 488 nm golflengte(excitatielicht) maar je kan niet één golflengte doorlaten --> enkel licht van 450- 550 nm doorlaten= excitatiefilter
2e filter= emissiefilter: laat enkel licht toe >515nm Alexa 488 w zichtbaar
6.
TEM vs SEM
Answer: transmissie vs scanning EM
TEM: dun preparaat, binnenkant bekijken
SEM: dikker preapraat, wordt in vacuüm afgescand en oppervlakte bekijken. Laagje goud/palladium--> geleidend vr elektricteit
Content preview
Samenvatting cytologie cel II (2017-2018)
Hoofdstuk 1: inleiding & techniek
a) Prepareren en observeren van cellen en weefsels
- Doel: cellen observeerbaar maken voor LM of EM
- Probleem: weefsel laat weinig licht/elektronen door & weinig contrast
- Oplossing: dun snijden en voldoende contrast aanbrengen
1) Fixeren
• Probleem: weefsel uit normale in vivo afbraakenzymen actief degradatie
• Oplossing: denaturatie van EW (enzymen stoppen)
o Koude fixatie: bevriezen van weefsel in vloeibare N2 (snel)
o Chemische fixatiemiddelen:
- EW cross-linken met formol, formaldehyde en glutaraldehyde
- EW neerslaan = precipiteren met alcohol of aceton
• Gevolg: enzymreacties worden gestopt & structurele componenten bewaard
• Nadeel: artefacten = veranderingen die tijdens fixatie zijn ontstaan
(structuurveranderingen (ontstaan lacune) of verplaatsing v componenten)
2) Inbedden
• Wat: gefixeerde materiaal omwikkelen en doordringen met inbedmiddel
• Inbedmiddel:
o substantie die in het weefsel indringt
o substantie die hard wordt
o materiaal snijdbaar in coupes (dunne plakjes)
o paraffine (meest gebruikt,LM), hars, plastics (EM)
o inbedmiddel = hydrofoob
krijg je niet in weefsel want > 60% H2O H2O onttrekken (dehydratatie)
reeks alcoholbaden (30-50-70-90%, absolute ethanol)
water vervangen door ethanol clearing met tolueen (alcohol verwijderen)
(tolueen is mengbaar met alcohol en hydrofobe inbedmiddel)
• Alternatief: ‘alternatieve’ inbedmiddelen= hydrofobe harsen waarop hydrofiele groepen
zitten en hydrofiele inbedmiddelen MAAR: minder stabiel en inferieure morfologie
3) Snijden
• Ingebed in paraffine (LM)
o Vrij zacht
o Coupes max. 10 m dik (10.10-6m), (doorlaatbaar voor licht)
o Verwarmd tot 55°C: smelt, indringen in weefsel (veel epitopen bewaard)
o Makkelijk uit weefsel weg etsen
o Snijden met microtoom uitgerust met stalen messen
o Coupes op glazen draagglas
• Ingebed in hars, plastics (EM)
o Harder
o Coupes max. 70 nm dik (70.10-9m), (doorlaatbaar voor elektronen)
o Polymerisatie hars: 60-65°C
1
, o Meeste harsen moeilijk uit weefsel weg te etsen
minder geschikt voor immuunkleuringen
o Snijden met microtoom uitgerust met diamanten/glazen messen
o Coupes op metalen (Cu,Ni) roostertjes = grids
4a) Kleuren (LM)
• LM
o Wit licht: spectrum van golflengtes (kleur)
o Contrast in coupes laag kleuren
o Kleurstoffen: (vaak) waterige oplossingen
o Coupes worden gedeparaffineerd (tolueen) (‘2e clearing’)
• Routinekleuring (voor LM) = haematoxyline-eosine
o Gebaseerd op aanwezigheid zure (-) en basische (+) bestanddelen
✓ Kern veel zure groepen (DNA, RNA, NISSL stof)
✓ Cytoplasma veel basische groepen (eiwitten met IEP bij basische pH-waarden)
o Kleurstoffen zelf:
✓ Kationische (+) basische kleurstof (H) reageert met zure (-) bestanddelen blauw
✓ Anionische (-) zure kleurstof (E) reageert met basische (+) bestanddelen rood/oranje
o Basofiel/eosinofiel:
✓ Basofiel = weefselcomponent reageert met + kleurstof = H blauw
✓ Eosinofiel = weefselcomponent reageert met – kleurstof = E rood/oranje
o Toegepast op de cel
✓ Kern > DNA en RNA (- geladen) H (+, basische kleurstof) blauw
✓ Cytoplasma > EW bij pH= 6 (+ geladen) E (-, zure kleurstof) oranje/rood
(blauwe korreling in cytoplasma ribosomen > rRNA en ribosomale EW)
• Cytochemie
o Proteïnen (eiwitten)
✓ Polymeren van AZ
✓ Basisstructuur AZ
✓ Zure (COO-) en basische (NH3+) , overmaat afhankelijk van pH en IEP
✓ pH= 6/7: EW vooral + geladen eosine (oranje)
o Nucleïnezuren (DNA/RNA)
✓ Nucleotide > pentose, base en fosfaatgroep
✓ Neg. lading, vooral in kern haematoxyline (blauw)
o Koolhydraten (suikers)
✓ Polysacchariden, enk. of samengest.
✓ Metachromasie:
Probleem: suikers lossen op in waterig fixatief gedeeltelijk verloren bij dehydratatie
Oplossing: stof bij fixatief toevoegen neerslag koolhydraten
Gevolg: kleurbaar met kationische kleurstof (H) kleuromslag v/d kleurstof (vw: dichte
schikking van – groepen) (gekleurde object krijgt andere kleur dan de gebruikte kleurstof)
Voorkomen: kraakbeen en mastcellen
o Lipiden (vetten)
✓ Vetzuren: Cn H2n+1 COOH
✓ Lossen op in alcohol niet kleurbaar volgens HE-routine
✓ EM: OsO4 als bijkomend fixatief (grote affiniteit voor vetzuren) (osmium tetroxide)
2
, 4b) Contrasteren (EM)
• EM
o Elektronen w versneld (1 λ)
o Geen kleuren
o λ buiten bereik vd gevoeligheid vh menselijk oog
o contrasteren = verhogen vd densiteitsverschillen dmv zware metalen (<-> HE bij LM)
• OsO4: - reeds bij fixatief
- affiniteit voor membranen (vetten)
• Uranylacetaat: - reageert met fosfaat en aminogroepen
nucleïnezuren (DNA/RNA) en EW Contrasteringsvloeistof
• Loodcitraat: - reageert met – groepen (uranyl- & loodcitraat)
nucleïnezuren (DNA/RNA)
structuren waar metalen opzitten zijn donker
metalen zorgen vr ‘scatter’ vd elektronen die bijgevolg niet bijdragen tot de beeldvorming
b) Specifieke kleurtechnieken
1) Indifferente kleurstoffen:
kleuren vetten aan
(vetten moeilijk te kleuren want lossen bij standaardkleuring op in alcoholbaden)
bv. oil red kleuring (rood)
2) Immunohistochemische kleuring:
met antilichamen (Ig): herkennen bepaalde EW
aan Ig: fluorescerend EW of goudpartikel
Immunocytochemische kleuring
o bv. met DAB
Immuno- goud kleuring (EM)
o AL met een goudpartikel EM
o Bv. Ig tegen catalase= anti-catalase hieraan goud hangen, nu kan je peroxisomen (catalase) lokaliseren
Immunofluorescentie (LM)
o We proberen cel te kleuren maar de cel is gesloten (AL kan enkel op antigenen (AG) vh buitenste
celoppervlakte binden), kan niet door de plasmamembraan diffunderen gaten maken in membraan
AL binnenbrengen interne antigenen detecteren met AL
o AL met fluorochroom (> fluor) LM
o INDIRECT: je hangt aan je 1e AL een 2e AL met fluorescerend deeltje
o DIRECT: je hangt aan je 1e AL het fluorescerend deeltje
o (bv. met AL tegen GLUT-2 = anti GLUT 2, hiermee GLUT-2 aantonen (fluorochroom aan anti GLUT-2))
Toepassing muco (cystic fibrosis):
o Mutatie CTFR-gen
o Lokalisatie van dit EW via immunohistochemische kleuring
o CTFR zou apicaal moeten zijn, bij muco zit dit veel meer in de cel
o Gemuteerd CTFR wordt niet meer naar de apicale kant van de cel gebracht, blijft in cytoplasma en wordt
hier snel afgebroken minder CFTR en niet meer apicaal
3) Enzymkleuringen:
activiteit enzymen aantonen: gebruik van een voor het enzym specifiek substraat => vorming neerslag
4) Autoradiografie:
histologische techniek metabolische activiteit visualiseren: radioactief gemerkte precursoren ingebouwd,
coupes maken, contact met fotografische emulsie
aan weefsel/cel een radioactief AZ hangen EW w radioactief
3
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller SamenvattingenGeneeskundeGent. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.75. You're not tied to anything after your purchase.
