Summary
Samenvatting Methoden in Biomedisch onderzoek 3
- Course
- Institution
Volledige samenvatting met afbeelding van methoden in biomedisch onderzoek 3.
[Show more]
Seller
Follow
AnetteVDB
Reviews received
Content preview
Basismethoden in het Biomedisch Onderzoek 3Analyse van DNA en genomics
DNA-sequentiebepaling
Brede toepassingen
- De novo genoom sequentiebepaling
o Ongekende genomen (nog geen referentiegenoom vh species)
o Bv Humaan Genoom project
o Nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
o Gedeeltelijk of volledig
- Resequencing
o Individuen tov referentiegenoom
o Verschillen tss individuen (SNPs): 3 miljoen vd 3 miljard basen versch
o Mutaties (ziekten)
o Construct verificatie
o Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica, NIPT (niet invasieve prenatale test), …
- Sequentiebepaling als teller: aantallen DNA (of RNA) moleculen (zie RNAseq, ChIPseq,…)
De novo sequencing vd resequencing
- WGS = whole-genome sequencing
- WES = whole-exome sequencing
o = coderende sequentie
o = 1.5% van genoom
- Targeted sequencing = specifieke gewenste regio’s
- Transcriptoom: RNA → cDNA
1ste generatie sequentiebepaling
Maxam en Gilbert: chemische klieving methode
- Differentiële chemische klieving (door resctrictie-enzymen) van NZ in 4 versch reacties, gevolgd door scheiding
volgens grootte op polyacryl-amidegel en visualisatie via autoradiografie (mbv radioactieve merkers)
- Nadeel: relatief korte fragmenten, niet helemaal specifiek → sequentie niet altijd éénduidig
Sanger sequencing = synthese met dideoxy-keten terminatie
- Template/matrijs = gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of een specifiek fragment
dat geamplificeerd wordt met PCR
- Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met versch fluorescente label)
o Reactie loopt door na inbouwen dNTP (deoxy-nt) → aan -OH kan verder gebouwd worden
o Reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP (dideoxy-nt) → aan -H kan niet verder gebouwd worden
Juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
- Scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram
- Beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen (vnl bij G-C: hebben 3 H-bruggen → plakken erg aan elkaar)
- Voor betrouwbaarheid: best 2 aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
- Elektroferogram aflezen
o 1ste 30 bp niet afleesbaar: vaak te veel fouten
o Meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede sequentie afleesbaar
o Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base (Phred-score)
▪ Phred score Q = -10*log10(P) → vb: score van 10 (99% ac), 20 = 1 op 100 (99%), ev
▪ P = probabiliteit van foutieve base call
1
, o Mutatiedetectie
▪ Niet altijd even hoge pieken
▪ Sequentie-fout vs mutatie? → forward en reverse reacties ter bevestiging
Verwezenlijkingen met 1st generetion sequencing (Sanger)
- Human Genome Project (HGP)= grootste multinationale biologische project ooit (1990-2001 (draft)-2003 (final))
o Stalen: meerdere anonieme individuen
o Methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode clones in YACs, BACs, P1s, cosmiden
▪ Fragmeteren (mbv RE) en mapping (volgorde bep mbv probes)
▪ Automatische sample bereiding en sequentiebepaling door 20 centers over heel de wereld
o Nog steeds updates (verschillende ‘genome builds’)
- Human Genome sequencing (2001)
o Stalen: 5 individuen
o Methode: whole genome shotgun sequencing
o Random clones, geen mapping
- Nieuwe uitdagingen
o Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
o Meer genomen sequencen van meerdere species
o Meer individuele humane sequenties
o Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
o Enorme mogelijkheden voor “personalized precision medicine”
▪ Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose, preventie
▪ Farmacogenomics: verklaart en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren op GM
▪ Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen (diabetes, kanker,..)
▪ Therapie op maat, bv al bij kanker
▪ Maar ook ethische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschappijen,…)
o Probleem met standaard Sanger sequencing: throughput en kosten
2de generatie sequentiebepaling: short-read next-generation sequencing
- = short-read next-generation sequencing (massief korte stukjes DNA sequencen)
- doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA sequentiebepaling mogelijk
- richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000 USD (“thousand-dollar genome”)
- Ontwikkeling van nieuwe technologie met 3 pijlers:
o Parallelle detectie (Massive parallel sequencing)
▪ Cluster of polony = kopieën van een DNA template
▪ Klonale in vitro amplificatie van template (<> klassieke klonering)→ miljoenen kopieën van DNA
template per cluster
▪ Multiplexing: vele clusters tegelijk (<> 1 template/reactie)
o Miniaturisatie van reacties
o Integratie van het proces (pipeline): directe detectie (<> scheiding fragmenten via gelelectroforese)
- Verschillende commerciële platformen: zeer competitief, snelle evolutie (545/Roche, Illumina, Ion Torrent, …)
- Gebaseerd op 4 stappen: aanmaak DNA library, klonale in vitro amplificatie, sequencing/sequeniebepaling, data
analyse
Aanmaak DNA library
- Library = fragmentenbank = verzameling van te sequencen templates
- Types DNA library:
o Whole genome sequencing (WGS)
o Mate Pair libraries
o Whole exome sequencing (WES) of targeted sequencing:
aanrijking door hybridisatie aan probes (in oplossing of op array)
(zie panel A) of PCR-gebaseerd (zie panel B)
o Amplicon sequencing: PCR amplicons, bv. diagnostisch panel
o cDNA library (RNA-seq – Zie Hfst RNA)
2
, - Procedure
o Input DNA → kwaliteitscontrole (staal bereiden: DNA extraheren)
▪ Hoeveelheid en concentratie essentieel: vnl vorming adapter-dimeren
▪ Zuiverheid, bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
▪ Integriteit, bv capillaire elektroforese
o Random fragmentatie (sonicatie, nebulisatie, Dnase I,…): versch gootte en uiteinden
o End repair
▪ Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment)
▪ 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase) = fosfaatgroep aanhechten met kinase om zo
adaptoren te kunnen aanhechten
▪ Eventueel 3’ non-template A aanhechten (Taq polymerase): proofreading
o Adapters aanhechten:
▪ Nodig voor PCR en sequencing primers + ev. indices/barcodes (per staal/molecule)
▪ Ligatie met fragment uiteinden (sticky end met 3’A overhang of blunt-end)
▪ Eventueel selectie van fragmenten met 2 versch adaptoren
▪ Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren, high-fidelity polymerasen met min
o Alternatief: tagmentatie → fragmentatie en adapters aanhechten in 1 stap
▪ Bv. in Illumina Nextera kit
▪ Transposase enzyme met dubbele activiteit: bindt op random plaatsen aan DNA → knipt en voegt
adapters toe
▪ PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adapters
o Size selection
o Doel: gewenste lengte inserts selecteren
o Klassiek: agarose gel-elektroforese: gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met alcoholprecipitatie of
ionenuitwisselingskolom
o Nieuwere selectie-methodes: magnetische beads binden DNA, verhouding DNA/beads bepaalt gebonden
lengte
• 1-zijdig: korte fragmenten zoals adapter-dimeren wegfilteren
• 2-zijdig: wegfilteren kleine en grote fragmenten
Magnetische beads gaan DNA binden → DNA kan gecapteerd worden mbv magneten
o Kwaliteitscontrole
▪ doel: gewenste lengte en C inserts controleren, gewenste verhouding voor poolen van libraries
bep
▪ capillaire elektroferose bv Agilent Bio-analyer
Klonale in vitro amplificatie
- Doel: simultane, maar gescheiden, amplificatie van miljoenen fragmenten
- Verschillende methoden om scheiding tss clusters te behouden (vaste fase = solid-phase, emulsie, oplossing)
- Emulsie PCR (bv. 454, IonTorrent)
o Beads met oligonucleotiden complementair aan adaptoren
o 1 fragment laten binden per bead
o PCR reagentia toevoegen
o Olie-emulsie maken → duizenden aparte reacties in 1 buisje
o On--bead amplificatie via PCR
3
, 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule gebonden op een bead
- Solid-phase bridge amplificatie (bv. Illumina)
o Vast opp met oligonucleotiden complementair aan de adptoren
o Fragmenten vormen lokaal bruggetjes via brownse beweging
o PCR
clusters (polonies) = 1000’en kopieën van zelfde DNA molecule op een 1-2 μm spot
- Solid-phase template walking ‘wildfire’ (bv. SOLiD)
o Opp met oligo’s complementair aan adaptoren
o Fragmenten laten binden
o Partiële denaturatie → vrije uiteinden ‘wandelen’ lokaal
o Amplificatie
1000den lokale clusters
- Rolling-circle amplificatie in oplossing (bv. Complete Genomics)
o Eerste van 4 adaptoren (rood) ligeren aan fragment dat men wil amplificeren
o Circulair DNA template maken via ligatie
o RE knippen downstream met type III endonuclease (bindt op een specifieke plek en knippen stukje
verder, type II knipt op plek van binding)
o 2e set adaptoren ligeren, circiuariseren en knippen → bindingsplaats voor nieuwe adaptoren → 2x herh
o Rolling circle amplificatie
o Clusters = nanoballs = concatemeren (lange DNA moleculen met meerdere kopieën van template na
elkaar)
o Hybridiseren op vaste drager
Sequencing van clusters/sequentiebepaling
- Sequencing-by-synthesis met reversible chain terminators (Illumina en GeneReader)
o Reversible chain terminators: fluorescent gemerkte nt dat een
terminatorketen heeft → 1 per keer inbouwen → aflezen stopt → adh van
kleur weet men welke nt is ingebouwd
o Terminatorgroep en fluorescente groep eraf gooien → opnieuw mengsel
van terminator-nt toevoegen
o Mog om miljoenen sequenties tegelijk te meten
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller AnetteVDB. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $10.04. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
84669 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now