Summary
samenvatting practicum biochemie &biotechnologie
- Course
- Institution
alles leerstof is gestructureerd samengesteld in dit document. Het bevat 20 blz. met veel foto's ter illustratie en lettergrootte 12
[Show more]
Seller
Follow
celbiologie
Content preview
SAMENVATTING Practicum biochemie enbiotechnologie
Plasmide DNA
Inleiding
DNA
- Volgorde nucleotiden bepaalt EW
- Bepaalt erfelijke eigenschappen organisme
Plasmide DNA
- Cirkelvormige dubbele streng DNA
- Grootte : 1 000 – 200 000 bp
- Functie : genetische info tussen bacteriën
uitwisselen.
- Dragen altijd ten minste 1 gen
Gunstig voor bacterie:
Nieuwe voedselbronnen aanspreken
Gifstoffen aanmaken
Resistentie tegen bepaalde antibiotica
- Onafhankelijk repliceren
Bevat stuk DNA dat dient als startpunt voor replicatie ‘origin of replication’
- Plasmiden artificieel aangemaakt bevatten selectiemarket
= een gen dat resistentie verschaft tegen bepaald antibioticum bv. Ampiciline
- Kunstmatige plasmiden : gebruikt om genetische modificaties uit te voeren.
Samengesteld uit DNA de gewenste eigenschappen aan cel kunnen
toevoegen/veranderen
Bepaalde structuren fluorescent aan kleuren
- Nieuwe genen bv. Insuline, GFP-actine worden in plasmide aangebracht m.b.v.
Restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen
Herkent specifieke DNA sequentie ( recognition site )
Knipt op die plek beide strengen
Vergemakkelijken invoeging van nieuwe genen in plasmide.
Vermeerderen van pdna in bacteriën
- Gewenste plasmide w opgewekt in bacteriën
- Bacteriën groeien in geschikte medium met antibiotica .
- Alleen bacteriën met plasmide en antibioticaresistentie groeien
1
, - Na groeiperiode worden bacteriën opengebroken
- Plasmiden geïsoleerd en DNA opgezuiverd
DNA opzuivering
Overzicht
- De opzuiveringsstappen die doorlopen
worden zijn:
- bacteriën lyseren om DNA te isoleren
- binden van het DNA aan de silica-kolom
- was-stappen om onzuiverheden weg te
wassen
- elutie van het DNA van de kolom
lyseren van bacteriën
- lysis-buffer om plasmide uit bacterie te isoleren
bevat enzymen en surfactanten die de celwand van de bacteriën kapot maakt=>
inhoud bacterie komt vrij => plasmide ook
- centrifugatie
grote celresten in pellet
macromoleculen in supernatans
Binden van DNA aan de silica-kolom
- Supernatans word op silica-kolom gebracht
- DNA en silica = negatief geladen
DNA afgestoten door silica
- DNA zal toch kunenn binden aan silica doordat we een oplossing toevoegen met een
lage pH (veel protonen => + ladingen) + een hoge zoutconcentratie ( veel positieve
tegenionen)
Wasstappen
- Zodra PdnA aan silica membraan is
gebonden
- Gewassen met zout-ethanol oplossing
Verwijderd onzuiverheden : EW ,
overtollige zouten…
- DNA blijft aan silica gebonden
Elutie
2
, - Elutiebuffer op silica-kolom
Heeft hoge ph (weinig protonen)
Lage zoutconcentratie (geen/weinig positieve tegen-
ionen)
Gevolg : pdna zal loskomen van silica tijdens
centrifugatie
HET DNA BEVIND ZICH NU IN HET ELUENS !!!
DNA concentratie bepalen via UV/VIS spectroscopie
- Eluens bevat onbekende concentratie plasmide DNA
- Concentratie bepaalt door UV/VIS spectroscopie
DNA : absorbantie max = 260nm
Onzuiverheden absorbantie max = 230 nm &
280nm
Men kan zuiverheid nagaan a.d.h.v. deze
absorbanties
DNA identificatie : Gel elektroforese
DRAGEN VAN HANDSCHOENEN EN VEILIGHEIDSBRIL IS VERPLICHT VOOR DIT ONDERDEEL !
Maken van de gel
- Agarose opgelost in buffer door verwarmen.
Toevoegen gelred (= kleurstof die aan DNA bindt en het fluorescent maakt)
- Oplossig in gelhouder gieten en 20min wachten tot het solideert
Laden van de gel
- De DNA-ladder + alle stalen worden in de gel geladen
Lopen van de gel
- Na inladen => elektroden aansluiten
Constant voltage : voor 40min-90min
Gedurende deze tijd zal het negatief geladen DNA van de negatieve naar de
positieve elektrode migreren.
UV-detectie
- DNA-bandjes gedetecteerd met behulp van UV licht
- De ladder : helpt bij identificeren van de groottes van de DNA stalen.
Zie video : interpretatie van de gel
3
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller celbiologie. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.52. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
79373 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now