Hogeschool Utrecht
Biotechnologie
VL5B
Renuka Ramlal
26-10-2016
, Inhoud
Les 1 – Introductie ...................................................................................................... 4
Inleiding en toepassingen van biotechnologie ......................................................... 4
Overwegingen bij keuze van expressiesystemen .................................................... 6
Les 2 – Isolatie en mutatie van een G.O.I................................................................... 8
Isolatie van een g.o.i. .............................................................................................. 8
Mutagenase en protein engineering ...................................................................... 13
Fusie eiwitten en in frame klonering ...................................................................... 17
Les 3 – Expressie door bacteriën ............................................................................. 20
Inleiding E.coli als expressiesysteem .................................................................... 20
Transformatie en selectie ...................................................................................... 21
Integratie G.O.I. in het gastheergenoom ............................................................... 22
Induceerbare expressie in E.coli ........................................................................... 23
E.coli expressieproblemen en oplossingen ........................................................... 25
Les 4 – Expressie door gist ...................................................................................... 28
Inleiding gist .......................................................................................................... 28
Gist vectoren en eiwitproductie ............................................................................. 29
Andere schimmels ................................................................................................. 34
Les 5 – Expressie met behulp van baculovirus ......................................................... 35
Natuurlijke cyclus baculovirus ............................................................................... 35
Baculovirus als expressievector ............................................................................ 36
Les 6 – Expressie door animale cellen ..................................................................... 40
Inleiding animale cellen ......................................................................................... 40
Animale vectoren (plasmiden) ............................................................................... 41
Transfectie, selectie en integratie .......................................................................... 43
Induceerbare expressie met tet-on/tet-off.............................................................. 46
Animale vectoren (virussen) .................................................................................. 47
Aangepaste cellen voor verhoogde productie ....................................................... 49
Voorbeelden medische toepassingen ................................................................... 51
1
,Les 7 – Expressie door transgene planten ............................................................... 53
Introductie genetisch gemodificeerde planten ....................................................... 53
Het maken van genetisch gemodificeerde planten ................................................ 53
Planten als productiesysteem................................................................................ 56
Les 8 – Genetisch gemodificeerde dieren ................................................................ 58
Toepassingen van genetisch gemodificeerde dieren ............................................ 58
Maken van een transgene muis ............................................................................ 59
Maken van een knock-out muis ............................................................................. 62
Induceerbare knock-outs met het Cre-loxP recombinatie systeem ....................... 65
Gene editing met het CRISP-Cas systeem ........................................................... 66
Les 9 – Gentherapie ................................................................................................. 67
Inleiding ................................................................................................................. 67
Strategieën ............................................................................................................ 67
Virale DNA delivery ............................................................................................... 69
Veiligheid virale vectoren ...................................................................................... 71
Niet-virale DNA delivery ........................................................................................ 72
Les 10 – Proceskunde voor de biotechnologie ......................................................... 73
Bioreactoren .......................................................................................................... 73
Downstream processing ........................................................................................ 77
2
,3
,Les 1 – Introductie
Inleiding en toepassingen van biotechnologie
Dit hele vak kan worden
samengevat door de afbeelding
hiernaast weer gegeven.
‘De genetische code is universeel’
Overzicht vectoren
Plasmide Bacterieel
2 µm circle
Shuttle plasmide
Virus Faag λ
Baculo
Retro
Vaccinia
Adeno
Plasmide – virus tussenvormen Cosmide (plasmide met faag λ cos sites)
Fosmide (plasmide met faag λ cos sites)
Phagemide (co-infectie plasmide met
M13 faag)
Artificieel chromosoom BAC
YAC
HAC
4
, Waarom DNA transfer?
Expressiesysteem
Expressievector met gekloneerd g.o.i. + Geschikte gastheercel → Hoe breng je deze
samen?
Begrippen m.b.t. DNA transfer (worden in de praktijk vaak door elkaar gebruikt)
Transfectie: Opname vreemd DNA (tijdelijk), meestal animale cel bedoeld.
Transformatie: Opname vreemd DNA (integratie in gastheer genoom, blijvend
veranderd), zowel animaal als prokaryoot.
Transductie: DNA overdracht tussen prokaryoten d.m.v. een faag.
Infectie: DNA transfer d.m.v. virale vector.
Methodes om DNA te transferen zijn
Overzicht DNA transfer methoden
E.coli CaCl2 + heatshock
Electroporatie
Animale cellen CaPO4 precipitatie
Lipofectie
Electroporatie
Retrovirussen
Gist Protoplast fusie
Electroporatie
Planten cellen Agrobacterium tumefaciens
Particle bombardment
Gene gun
DNA whisker (koolstof naaldjes)
Plantenvirussen
Er zijn 4 domeinen in de biotechnolgie:
Wit – Industriele toepassingen Waspoeder (biotex) met enzymen als proteases en
lipases.
Groen – Landbouw (voeding) toepassingen Resistentie tegen schimmels, insecten
en droogte van landbouwgewassen. Glutenvrij graan of rijst met extra vitamine-A
(tegen rivierblindheid)
Rood – Medische (farmaceutische) toepassingen Correctie van LPL deficiëntie3
door gentherapie. Hierbij wordt een virus ingespoten met een gen dat wel functioneert.
Hierdoor gaat het lichaam alsnog het deficiënte enzym aanmaken.
Blauw – Milieu / aquatische / mariene toepassingen Biologisch opschonen van
industrieel afval. Opruimen olie/gif lekkage m.b.v. bacteriën.
Overige toepassingen van biotechnologie in Wetenschappelijk onderzoek, Biologische
wapens en ‘’Bio-art’’.
5
Biotechnologie
VL5B
Renuka Ramlal
26-10-2016
, Inhoud
Les 1 – Introductie ...................................................................................................... 4
Inleiding en toepassingen van biotechnologie ......................................................... 4
Overwegingen bij keuze van expressiesystemen .................................................... 6
Les 2 – Isolatie en mutatie van een G.O.I................................................................... 8
Isolatie van een g.o.i. .............................................................................................. 8
Mutagenase en protein engineering ...................................................................... 13
Fusie eiwitten en in frame klonering ...................................................................... 17
Les 3 – Expressie door bacteriën ............................................................................. 20
Inleiding E.coli als expressiesysteem .................................................................... 20
Transformatie en selectie ...................................................................................... 21
Integratie G.O.I. in het gastheergenoom ............................................................... 22
Induceerbare expressie in E.coli ........................................................................... 23
E.coli expressieproblemen en oplossingen ........................................................... 25
Les 4 – Expressie door gist ...................................................................................... 28
Inleiding gist .......................................................................................................... 28
Gist vectoren en eiwitproductie ............................................................................. 29
Andere schimmels ................................................................................................. 34
Les 5 – Expressie met behulp van baculovirus ......................................................... 35
Natuurlijke cyclus baculovirus ............................................................................... 35
Baculovirus als expressievector ............................................................................ 36
Les 6 – Expressie door animale cellen ..................................................................... 40
Inleiding animale cellen ......................................................................................... 40
Animale vectoren (plasmiden) ............................................................................... 41
Transfectie, selectie en integratie .......................................................................... 43
Induceerbare expressie met tet-on/tet-off.............................................................. 46
Animale vectoren (virussen) .................................................................................. 47
Aangepaste cellen voor verhoogde productie ....................................................... 49
Voorbeelden medische toepassingen ................................................................... 51
1
,Les 7 – Expressie door transgene planten ............................................................... 53
Introductie genetisch gemodificeerde planten ....................................................... 53
Het maken van genetisch gemodificeerde planten ................................................ 53
Planten als productiesysteem................................................................................ 56
Les 8 – Genetisch gemodificeerde dieren ................................................................ 58
Toepassingen van genetisch gemodificeerde dieren ............................................ 58
Maken van een transgene muis ............................................................................ 59
Maken van een knock-out muis ............................................................................. 62
Induceerbare knock-outs met het Cre-loxP recombinatie systeem ....................... 65
Gene editing met het CRISP-Cas systeem ........................................................... 66
Les 9 – Gentherapie ................................................................................................. 67
Inleiding ................................................................................................................. 67
Strategieën ............................................................................................................ 67
Virale DNA delivery ............................................................................................... 69
Veiligheid virale vectoren ...................................................................................... 71
Niet-virale DNA delivery ........................................................................................ 72
Les 10 – Proceskunde voor de biotechnologie ......................................................... 73
Bioreactoren .......................................................................................................... 73
Downstream processing ........................................................................................ 77
2
,3
,Les 1 – Introductie
Inleiding en toepassingen van biotechnologie
Dit hele vak kan worden
samengevat door de afbeelding
hiernaast weer gegeven.
‘De genetische code is universeel’
Overzicht vectoren
Plasmide Bacterieel
2 µm circle
Shuttle plasmide
Virus Faag λ
Baculo
Retro
Vaccinia
Adeno
Plasmide – virus tussenvormen Cosmide (plasmide met faag λ cos sites)
Fosmide (plasmide met faag λ cos sites)
Phagemide (co-infectie plasmide met
M13 faag)
Artificieel chromosoom BAC
YAC
HAC
4
, Waarom DNA transfer?
Expressiesysteem
Expressievector met gekloneerd g.o.i. + Geschikte gastheercel → Hoe breng je deze
samen?
Begrippen m.b.t. DNA transfer (worden in de praktijk vaak door elkaar gebruikt)
Transfectie: Opname vreemd DNA (tijdelijk), meestal animale cel bedoeld.
Transformatie: Opname vreemd DNA (integratie in gastheer genoom, blijvend
veranderd), zowel animaal als prokaryoot.
Transductie: DNA overdracht tussen prokaryoten d.m.v. een faag.
Infectie: DNA transfer d.m.v. virale vector.
Methodes om DNA te transferen zijn
Overzicht DNA transfer methoden
E.coli CaCl2 + heatshock
Electroporatie
Animale cellen CaPO4 precipitatie
Lipofectie
Electroporatie
Retrovirussen
Gist Protoplast fusie
Electroporatie
Planten cellen Agrobacterium tumefaciens
Particle bombardment
Gene gun
DNA whisker (koolstof naaldjes)
Plantenvirussen
Er zijn 4 domeinen in de biotechnolgie:
Wit – Industriele toepassingen Waspoeder (biotex) met enzymen als proteases en
lipases.
Groen – Landbouw (voeding) toepassingen Resistentie tegen schimmels, insecten
en droogte van landbouwgewassen. Glutenvrij graan of rijst met extra vitamine-A
(tegen rivierblindheid)
Rood – Medische (farmaceutische) toepassingen Correctie van LPL deficiëntie3
door gentherapie. Hierbij wordt een virus ingespoten met een gen dat wel functioneert.
Hierdoor gaat het lichaam alsnog het deficiënte enzym aanmaken.
Blauw – Milieu / aquatische / mariene toepassingen Biologisch opschonen van
industrieel afval. Opruimen olie/gif lekkage m.b.v. bacteriën.
Overige toepassingen van biotechnologie in Wetenschappelijk onderzoek, Biologische
wapens en ‘’Bio-art’’.
5
