Summary
Samenvatting - Practicum: biotechnologie en biochemie, Primer Design + Restrictie-enzymen (J000496A)
- Course
- Institution
Volledige samenvatting van Practicum Primer Design en Restrictie-enzymen Leerpaden + powerpoints
[Show more]
Seller
Follow
marthevanlerberghe
Content preview
Practicum Primer design + REPCR
1/ Wat is PCR?
= Polymerase Chain Reaction
Uitgevonden door Kary Mullis in 1983
Doel: enorme hoeveelheden kopieën genereren van welbepaalde DNA-sequentie
Waarom: genen = zeldzame doelwitten in complex genoom
PCR: genoeg van gen/dna om analyse te starten
2/ Principe van PCR
Uitgangsmateriaal PCR: DNA dat sequentie bevat die geamplificeerd dient te worden
Reactiemengsel
o DNA-polymerase
Enzym verantwoordelijk voor het uitvoeren vd reactie
Gebruikt tijdens DNA-replicatie
o 2 primers: forward & reverse
o dNTPs (A, C, G, T)
Desoxynucleotidetrifosfaten
Bouwstenen DNA
o MgCl2
Co-factor voor DNA-polymerase enzym werkt optimaal
o Buffer
Mengsel op bepaalde pH houden reactie optimaal laten doorgaan
3 stappen in PCR
o Denaturatie
o Annealing
o Elongatie
1 cyclus, n keer herhalen (afh. van aantal
keer nodig)
Denaturatie
o Reactiemengsel wordt opgewarmd tot 95°C-
96°C
o Dubbelstrengig DNA valt uiteen in 2
enkelstrengige DNA-moleculen
= Template DNA voor primers die aanhechten
Annealing
o Mengsel wordt afgekoeld tot ongeveer 60°C (afh van primers)
o Primers aangehecht aan template-DNA
o Kort stuk dubbelstrengig DNA aanwezig, nodig voor DNA-polymerase om aan te
binden
o DNA-polymerase zal adhv. Template-DNA de complementaire basen aanbrengen
Elongatie
o Bij 72°C : optimale T voor DNA-polymerasen om functie uit te voeren
, o Nieuwe gesynthetiseerde strengen strekken zich uit tot voorbij primer op
tegenovergestelde streng
o Er worden nieuwe primer-bindingsplaatsen gecreëerd op elk nieuw gesynthetiseerde
DNA-streng
Na n cycli bevat de reactie een theoretisch maximum
o 2n dubbelstrengige DNA-moleculen = kopieën van DNA-sequenties tss. beide primers
3/ Primers
Kort stuk enkelstrengig DNA, nodig om PCR reactie te starten
Synthetisch aangemaakt
2 primers nodig: forward & reverse
o Forward
Bindt op backward DNA streng
Van 3’ 5’
o Reverse
Bindt op forward DNA streng
Van 5’ 3’
Tm = smelttemperatuur
o Helft primer gebonden op DNA-template en de helft in het mengsel voorkomt als
enkelstrengige DNA-molecule
o Bepaalt annealing temperatuur (ideaal: 3/5°C lager dan laagste Tm vd. primers)
Eigenschappen goede primer
o 20-30 basenparen lang
o Unieke sequentie
Primer enkel thv. targetsequentie binnenkomen
o Ze mogen geen inverted repeats bevatten (hairpins)
Stukje in primer waarvan de complementaire sequentie al een beetje
verder in de primer ook al voorkomt
2 stukken binden aan elkaar want complementair vormt hairpin/loop
Primer kan niet meer binden op DNA-template
o Geen complementariteit tss. forward en reverse primer
Gaan primer dimers vormen
Binden op elkaar, niet meer beschikbaar om te binden op DNa-template
o 3’ uiteinde primer
Rijk aan G en C
Vormen sterkste binding met elkaar, 3 H-bruggen tov. 2 H-bruggen bij A en T
Geen misprime: niet complementair met DNA-template (aan 3’ want elke
nieuwe DNA-streng wordt gesynthetiseerd van 5’ nr. 3’)
Primer moet goed binden thv. 3’ uiteinde: van daaruit start elongatie
o Tm mag max. 3°C verschillen tss. forward en reverse primer
Hechten bij dezelfde annealingtemperatuur aan het DNA-template
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller marthevanlerberghe. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $9.37. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
79271 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now