Summary
MethodenInBiomedischOnderzoek2_Samenvatting
- Course
- Institution
Samenvatting van de slides van methoden in het biomedisch onderzoek 2 - 2de jaar Biomedische Wetenschappen aan de KUL
[Show more]
Seller
Follow
FleurB25
Reviews received
Content preview
Methoden in biomedisch onderzoek 2Hoofdstuk 2: Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
- Zeer breed gamma aan vraagstellingen:
o Fysiologie (hoe werkt het lichaam?) ↔ pathologie (wat loopt fout?)
- Verschillende niveau’s: organisme – weefsel – cel – subcellulair
o Mens zelf of modelorganismen (rhesusaap, muis, cavia)
- Open exploratief onderzoek ↔ hypothese gedreven onderzoek
- Stroom onderzoeken: fundamenteel onderzoek → translationeel onderzoek → klinisch onderzoek
- Onderzoeken in vivo, ex vivo, in vitro of in silico
Hoofdstuk 3: RNA
1. Inleiding
- RNA is korter dan DNA, nucleotiden bevatten 2’ OH-groepen (vatbaar voor RNasen)
- Meestal enkelstreng, mogelijk in secundaire (2D) of tertiaire (3D) structuur
- Verschillende vormen RNA: coderend (mRNA) of niet-coderend (ncRNA)
o Non-coding rRNA (ribosomaal RNA) is 80-95% van totale massa
- Structuur: RNA wordt van DNA afgeschreven, complementair aan de matrijs met T→U
o Bevat geen intronen door splicing van pre-MRNA
o Bevat een polyA-staart
2. Werken met en bewaren van RNA: voorzorgen
- Mogelijke problemen
o RNA-profiel veranderd na staalname
o RNA-degradatie door endogene of exogene RNasen
o DNA-contaminatie: scheiding DNA/RNA meestal onvolledig
- Staalname
o Keuze anticoagulans: best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA reacties
o RNA-stabilisatie: degradatie of verandering voorkomen
▪ Onmiddellijk invriezen (vloeibare stikstof)
▪ Totaal bloed: in vacuümtube met RNA-bewaarmiddel
▪ Cellen/weefsel: in een RNA-bewaarmiddel
- Staalverwerking: RNase-vrij werken (filtertips, milliQ-water, RNase inhibitoren)
- Bewaring: tot 1 jaar in -80 °C in RNase-vrij water of langer als alcoholprecipitaat
- DNA-contaminatie: niet altijd een probleem, wel wanneer enkel RNA geanalyseerd wordt
o Detectie: RTmin controle of elektroforese
o Verwijderen: DNase behandeling: tijdens of na RNA-extractie
▪ Enzym inactiveren of verwijderen na behandeling
▪ Nadeel: mogelijk ook RNA-beschadiging
3. RNA extraheren
- Algemeen 3 stappen: lysis-isolatie-oplossen/concentreren
- Methode afhankelijk van het startmateriaal en doel (hoeveelheid, zuiverheid, aantal stalen)
- Lysis
o Remmers van niet-gewenste moleculen toevoegen (DNasen, proteasen…)
o Meest gebruikt: detergenten zoals SDS, guanidium thiocyanaat
o Vriezen-ontdooien, mechanische homogenisatie (bevriezen in stikstof en vermalen), vloeibare
homogenisatie (oplossing tussen glaasjes) of sonicatie (geluidsgolven) worden ook gebruikt
,- RNA extractie met organische solventen: scheiding op basis van verschillende oplosbaarheid in
verschillende oplossingen
o Trizol: guanidium thiocyanaat-phenol (= lysis en RNase inhibitor)
o Methode is een guanidium thiocyanaat-phenol-chloroform extractie, gevolgd door een
alcoholprecipitatie van RNA uit de waterfase of scheiding op een kolom
▪ ! in zure omstandigheden: verschil in pH en lading DNA/RNA zorgt voor scheiding
• RNA in waterlaag
• DNA in organische laag
- Alcohol precipitatie: idem als DNA alcoholprecipitatie, zowel opzuivering (ontzouten, verwijderen
detergentresten…) als concentratie van RNA
- Extractie dmv kolomchromatografie (silica kolom)
o Principe: zout- en pH-condities zorgen voor selectieve binding van RNA aan matrix in de kolom,
na elutie (obv zwaartekracht, centrifugeren of vacuüm) van niet-bindende moleculen worden de
condities veranderd en komt RNA los van de kolom
o ! verwijdering van DNA niet 100%
o Zouten: chaotrope zouten=RNase inhibitoren
o Automatisering: met magnetische silicabeads die RNA binden, magneet tegen kolom en rest
aspireren
4. RNA kwantificeren
- Als inschatting van opbrengst en kwaliteitscontrole
- ! hoeveelheid RNA verschilt per cel/weefseltype
- Spectrofotometrie
o Voordeel: snel, eenvoudig, concentratie én zuiverheid
o Nadeel: aspecifiek, mogelijke overschatting, geen onderscheid DNA/RNA
o Concentratie bereken adhv Lambert-Beer (bij 260nm)
- Fluorimetrie: fluorescente kleurstof bindt selectief aan DNA of RNA (SYBR Green, Ribogreen)
o Voordeel: selectiever voor RNA, nauwkeuriger, gevoeliger
o Nadeel: duurde en omslachtiger
- Elektroforese: RNA migreert van negatieve naar positieve pool door matrix bij agarose elektroforese.
Capillaire elektroforese met fluorescente kleurstof.
o Voordeel: concentratie, intactheid en lengte
o Nadeel: enkel semikwantitatief bij agarose, duur bij capillair
5. RNA concentreren
- Alcoholprecipitatie of kolom
- Met concentrators: centrifugatie door een filter die scheidt volgens grootte
- Speedvac: concentratie door verdamping van het solvent in een centrifuge onder vacuüm
,6. RNA in vitro aanmaken
- Korte fragmenten: RNAi aanmaken, lange fragmenten: bestuderen van RNA structuur en interacties
- In vitro transcriptie: mbv DNA-afhankelijke RNA polymerasen van bacteriofagen (DNA als template)
o Mogelijke templates: plasmide, PCR-amplicon, cDNA
o Initiatie: binding Pol aan promotor
o Elongatie 5’ → 3’ (U ipv T)
o Terminatie: terminatie-signaal of einde DNA fragment
7. RNA reverse transcription
- Reverse transcriptasen: RNA-afhankelijke DNA polymerasen (retrovirussen, telomerasen)
o RNaseH activiteit: breekt RNA-cDNA hybriden af
- In vitro: RNA → complementair DNA (cDNA) voor verder onderzoek
- Reactie
o Reagentia: RNA-template, reverse transcriptase, primers, dNTPs, buffer (met DDT en een
RNase inhibitor), nuclease-vrij water
o Reactieverloop: annealing – primerextentie en DNA polymerisatie – enzyme inactivatie
- Primers zijn complementair met PolyA van mRNA (heeft 3’ bias) of random primers (gelijkere
vertegenwoordiging)
- Genspecifieke primers worden gebruikt voor aanrijking weinig abundante targets
- cDNA kloneren: expressievectoren aanmaken en een library aanleggen
o Dubbelstreng cDNA nodig: synthese 1 e en 2e streng door RT, daarna PCR
o 4 manieren
▪ Blunt end cloning: synthese 2 strengen + ligatie van blunt ends in vector
▪ Directioneel: tijdens cDNA synthese extra seq. toevoegen om in vector te passen
▪ Ligatie-onafhankelijk: 3’ overhangende polymeer zorgt voor stabiliteit, ligatie niet
noodzakelijk, gebeurd tijdens transformatie in bacteriën
▪ Gen-specifiek: PCR fragment kloneren in plasmide
- Rapid amplification of cDNA ends (RACE): snelle amplificatie voor specifiek target tussen gekende
sequentie
o RT gevolgd door PCR: combo gen-specifieke primer en algemene primer
o Toepassing: onderzoek van alternatieve promotoren, transcriptie-start sites, alternatieve
splicing en verwante mRNA moleculen
o Vervangen door Next-gen sequencing
, 8. RNA analyseren
- Humaan genoom en transcriptoom: ong 20k genen en 200k transcripten
- Doel: transcripten identificeren, genexpressie meten
- Northern blot: RNA scheiden op denaturerende gel, blotten naar membraan, radioactief- of
fluorescent-gelabelde probe hybridiseren en detecteren met autoradiogram of laser
o Voordelen: probe hoeft geen 100% match te zijn → mogelijkheid om homologe RNA’s te zoeken in
andere species, geen omzetting nodig tot cDNA
o Nadelen: werkt slecht op partiëel gedegradeerd RNA, gelijkaardige fragementen geven dikke
banden die niet te scheiden zijn, oude technologie
- Kwantitatieve PCR: qPCR en RT-qPCR (reverse transcriptase): detectie van PCR-amplicons obv
fluorescentie (dye-based of probe-based)
o Fluorescentie komt overeen met #kopieën
o Plot hoeveelheid PCR product tov cyclusgetal: Ct=treshold cycle → waar fluorescentie
detecteerbaar wordt
▪ Hoe lager de Ct, hoe meer RNA in initiële reactie zat
o Kan 1 of 2-staps: RT-reactie en qPCR samen of apart
o Absolute kwantificatie adhv een standaardcurve van verdunningsreeks
o Efficiëntiebepaling (E): fractie van moleculen die gecopieerd wordt in 1 cyclus
▪ Nx=N0(1+E)x met Nx= aantal moleculen na x-cycli en N0 het origineel aantal targets
▪ Efficiëntie afhankelijk van primer en template structuur, reagentia concentraties,
reactiecondities, polymerase-inhibitie
o Relatieve kwantificatie: ΔΔCt methode = ΔCt teststaal- ΔCt referentiestaal
▪ RQ (relative quantity)= 2^-ΔΔCt
- ddPCR (droplet digital PCR): PCR in micellen met probe- of dye-based endpoint detection
o #templates per cel is Poisson verdeeld!
o Kan vanaf 10% verschil in expressie meten
- RNA-FISH: fluorescence in situ hybridisation: gemerkte probe hybridiseerd met cellen of
weefselcoupe: laat toe expressie te lokaliseren in weefsel
o Kan single-molecule (smRNA-FISH): detectie van individuele RNA transcripten,
signaalamplificatie nodig
o In multiplex met verschillende probes
- In situ PCR: op cellen of weefselcoupe: expressie lokaliseren
o Primers met hapteen-label worden gecapteerd door antistof tegen het hapteen
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller FleurB25. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $9.28. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
81113 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now