Uitwerking van het practicum eiwitten van de cursus Metabolisme. In het practicum wordt mbv de analysetechnieken SDS-PAGE en Western-Blot het molecuulgewicht van eiwit x bepaald en de eiwitconcentratie van eiwit y.
Eiwitten: gel-elektroforese en kwantitatieve
bepaling
Samenvatting
In dit practicum hebben we twee experimenten uitgevoerd. Als eerste hebben we onderzoek
gedaan naar een eiwit door middel van SDS-PAGE en Western Blot. Hierdoor probeerden we
erachter te komen wat het molecuulgewicht van dit eiwit is, of het eiwit uit meerdere sub-units
bestaat, of die sub-units aan elkaar zitten met zwavelbruggen en hoe de structuur van het eiwit
eruitziet. Bij het eerste experiment kwamen we erachter dat eiwit X een gewicht heeft van 25
kDa en eiwit Y van ongeveer 300 kDa, ook bestond eiwit Y uit 6 sub-units verbonden door
zwavelbruggen.
In het tweede experiment hebben we een kwantitatieve eiwitbepaling volgens Lowry gedaan.
Hierdoor wilden we erachter komen wat de eiwitconcentratie in kalverserum is. Uit onze
berekeningen bleek de eiwitconcentratie van het kalverserum 43,6 g/L te zijn.
Inleiding
In het eerste experiment wordt onderzoek gedaan naar een eiwit in een eiwitmengsel met
behulp van SDS-PAGE en Western Blot.
SDS-PAGE is een methode om eiwitten op basis van grootte te scheiden. SDS bindt non-
covalent aan eiwitten waardoor de eiwitten uniform negatief geladen worden en in de gel naar
de positieve pool getrokken zullen worden. De eiwitten worden aangebracht op een gel van
gepolymeriseerd acrylamide, deze gel heeft een soort zeefwerking wat de eiwitten op grootte
scheidt. De kleinste eiwitten bewegen het makkelijkst door de gel en zullen het laagst eindigen.
De gel bestaat uit twee delen een zogenaamd stacking gedeelte en een separating gedeelte.
Het stacking gedeelte bevat een laag percentage polyacrylamide (grof netwerk) waardoor alle
eiwitten worden samengedrukt en tegelijk aankomen bij het tweede gedeelte van de gel, het
separating gedeelte. Het separating gedeelte heeft een hoog percentage polyacrylamide (fijn
netwerk) en hier vindt de eigenlijke scheiding van eiwitten op basis van grootte plaats.
Western blotting is een techniek waarmee een specifiek eiwit in een eiwitmengsel kan worden
geïdentificeerd met behulp van antilichamen. Eiwitten, die gescheiden zijn door SDS-PAGE,
worden elektroforetisch overgebracht op een membraan. Het eiwit wordt zichtbaar gemaakt
(=blotten) door het membraan te incuberen met een antilichaam dat aan eiwit van interesse
bindt. Het antilichaam is gelabeld met een fluorescente groep of een enzym. Met deze
methodes proberen we het molecuulgewicht van een specifiek eiwit te bepalen en te bepalen of
een eiwit uit meerdere sub-units bestaat die met zwavelbrug(gen) aan elkaar vast zitten en of
we een idee kunnen krijgen van de structuur van het eiwitcomplex. Bij het tweede experiment
maken we gebruik van spectrofotometrie om de concentratie van een stof te bepalen. Er wordt
door een spectrofotometer gemeten hoeveel licht van een bepaalde golflengte door een stof
wordt geabsorbeerd. Aan de hand van de hoeveelheid licht die wordt geabsorbeerd kan de
concentratie van de stof bepaald worden.
1
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller stuudentjuh. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.26. You're not tied to anything after your purchase.
