Summary
Samenvatting Moleculaire Biotechnologie
- Course
- Institution
Uitgebreide samenvatting voor moleculaire biotechnologie, leerjaar 2 2023/2024. Alle bijbehorende stof uit de campbell is ook in de samenvatting verwerkt.
[Show more]
Seller
Follow
dewithnicolien
Content preview
Leerstof Moleculaire BiotechnologieHoorcollege 1: Genetische merkers en DNA-technieken
Genetische merkers
Genetische merkers zijn stukjes DNA, RNA, of eiwit. Met
genetische merkers kan je variatie in het DNA en de
genexpressie zichtbaar maken. Je kunt de variatie op 3
niveaus zichtbaar maken:
- DNA: genetische variatie. Verschil te zien op
nucleotiden. Eén verschil in een nucleotide in de
DNA template strand kan leiden tot een ander
mRNA molecuul.
- (m)RNA: verschillen in genexpressie. Het mRNA
molecuul is anders (door een verschil in nucleotide).
- Eiwit: verschillen in genexpressie en/of genetische variatie. Het eiwit dat wordt
gevormd is door een andere nucleotide, en andere mRNA streng ook anders.
Wat kan je met een DNA molecuul
DNA technieken zijn allemaal gebaseerd op:
• DNA extractie
• DNA knippen (restrictie)
• DNA plakken (ligatie)
• DNA hybridisatie (twee complementaire enkelstrengs moleculen (ssDNA) strengen aan
elkaar binden)
• DNA kopiëren (replicatie / amplificatie)
• Meten/visualiseren
Hoe kom je aan een DNA molecuul
DNA kan vrijgemaakt worden uit cellen: DNA extractie. Genetische merker technieken a.d.h.v. DNA
beginnen met DNA extractie. Afhankelijk van het monster en de bron zijn er verschillende methoden
voor extractie. Om het DNA uit het weefsel, de cellen en de celkern te extraheren zijn er
mechanische handelingen en chemische reacties nodig. Celwanden, celmembranen en eiwitten
moeten worden afgebroken, terwijl degradatie van het DNA moet worden voorkomen. Vervolgens
moeten de verschillende componenten gescheiden worden.
In een eukaryote cel zijn 3 DNA-bronnen mogelijk:
chloroplast, mitochondriën en de celkern. Bij het vrijmaken
van DNA moeten celwanden, membranen, eiwitten (histonen,
DNAses) e.d. afgebroken worden.
DNA kan verzameld worden door:
- Het openbreken van de cellen (lysis): door weefsel fijn
te malen, en/of door een soort zeep toe te voegen waardoor het celmembraan uit elkaar
valt.
- Eiwitten verwijderen (niet altijd nodig): eiwitten worden meestal afgebroken door een
protease enzym toe te voegen dat eiwitten afbreekt.
, - DNA ‘uit oplossing halen’: door een ijskoude alcohol toe te voegen, slaat het DNA uit de
oplossing neer. DNA is namelijk minder goed oplosbaar in een alcohol dan in water. Het
neergeslagen DNA kan vervolgens uit de oplossing worden gehaald, bijvoorbeeld door te
centrifugeren of door het met een pipet op te zuigen.
DNA kan ook chemische gemaakt worden: DNA synthese
DNA restrictie: knippen
Restrictie enzymen knippen een specifieke DNA sequentie van een dubbele helix. Verschillende
restrictie enzymen knippen verschillende sequenties. Genecloning en
genetische manipulatie zijn vaak afhankelijk van enzymen die DNA
moleculen bij een bepaald aantal of op een specifieke locatie knippen.
De enzymen die hierbij gebruikt worden zijn restrictie enzymen.
Restrictie-enzymen beschermen de bacteriële cel door vreemd DNA van
andere organismen of fagen in stukken te snijden. (Faag = een virus dat
bacteriën infecteert; ook wel bacteriofaag.) Elk restrictie enzym is heel
specifiek in het herkennen van een hele korte DNA sequentie, of
restrictiesite, een specifieke volgorde in een DNA-streng die herkend en
opgeknipt wordt door een restrictie-enzym. De restrictie-enzymen
knippen beide DNA strengen op precieze punten in de restrictiesite. Het
DNA van een bacteriële cel wordt beschermd van de cel zijn eigen
restrictie enzymen door het toevoegen van methylgroepen (-CH3) aan adenine of cytosine in de
sequentie die de enzymen herkend.
Restrictie-enzymen worden gebruikt om een vreemd DNA fragment in een bacteriële plasmide te
kopiëren. De meeste restrictionsites zijn symmetrisch, de sequentie van nucleotiden is op beide
strengen gelijk vanaf de 5’-> 3’ richting. De meest gebruikte restrictie enzymen herkennen
sequenties die uit vier tot acht nucleotide paren bestaan. Omdat veel sequenties die zo kort zijn veel
voorkomen in een lang DNA molecuul, zal het enzym veel knippen maken in een DNA molecuul, wat
een reeks aan restrictiefragmenten oplevert. Omdat restrictie enzymen op exact dezelfde DNA
sequentie knippen, produceren kopieën van elk DNA molecuul die aan restrictie-enzymen
blootgesteld worden altijd exact dezelfde restrictiefragmenten.
Restrictie-enzymen
Natuurlijke functies van restrictie-enzymen in de cel zijn: bijvoorbeeld het vernietigen van virus DNA
of het inbouwen van opgenomen genen in bacteriechromosomen. Restrictie-enzymen zijn
commercieel verkrijgbaar in veel varianten. Ze worden gebruikt om DNA moleculen willekeurig of
gericht kleiner te maken. Sommige restrictie-enzymen knippen het DNA recht door midden (blunt),
anderen knippen het DNA ‘diagonaal’ en zorgen voor korte enkelstrengse uiteinden (sticky ends).
Het voordeel van sticky ends is dat het beter blijft plakken aan specifieke delen.
DNA ligatie: plakken ‘backbone’
Bij DNA ligatie wordt een enzym gebruikt die de vorming van
covalente bindingen katalyseert die de suiker-fosfaat hoofdketens van
DNA strengen sluit. Een tijdelijke combinatie van DNA fragmenten die
gevormd wordt, kan door DNA ligatie permanent gemaakt worden.
Dit wordt gedaan door het plakken van suikerfosfaatketens door een
ligase-enzym. Ligatie is bijvoorbeeld nodig bij: het inbouwen van
conjugatieve plasmiden (dsDNA) in een bacterieel chromosoom, het
,inbouwen van ssDNA na transformatie voordat hybridisatie plaats vindt en het inbouwen van dsDNA
na transductie door een transducing particle. Ligase speelt een rol in DNA replicatie waar het één
streng van een dubbelstrengs DNA molecuul aan elkaar maakt, maar ligase kan juist ook DNA
moleculen waarvan beiden complementaire strengen verbroken zijn weer aan elkaar maken. Dit
kost ATP. Het mechanisme van DNA-ligase berust erop dat het op de gebroken plaatsen een
covalente fosfodi-esterbinding tussen het 3'-hydroxyleinde van het ene nucleotide met het 5'-
fosfaateinde van het andere nucleotide kan vormen.
Bij hybridisatie moeten de waterstofbruggen
doorgebroken worden. Bij hybridisatie worden twee
DNA strengen bovenop elkaar geplakt. Bij ligase worden
afgeknipte stukken van dubbele strengen aan elkaar
geplakt.
DNA hybridisatie
DNA hybridisatie is de vorming van complementaire
baseparen door twee enkelstrengs moleculen met
elkaar te verbinden met waterstofbruggen. Bij de DNA
replicatie verzorgt DNA-polymerase de hybridisatie. DNA hybridisatie, of nucleïnezuurhybridisatie is
de baseparing van de ene streng nucleïnezuur met de complementaire volgorde op een streng van
een ander nucleïnezuurmolecuul, van DNA of RNA.
DNA replicatie (herhaling)
Een ontwindt gedeelte van de ouderlijke DNA streng kan gebruikt worden als template voor de
synthese van nieuw, complementair DNA. De enzymen die DNA synthetiseren kunnen de synthese
van een polynucleotide niet initiëren. Ze kunnen alleen DNA nucleotiden toevoegen aan het eind van
een bestaande keten die gebasepared wordt met de template streng. De al bestaande keten wordt
geproduceerd tijdens de DNA synthese. Dit kleine stukje DNA is eigenlijk RNA, de RNA keten is de
primer en die wordt gesynthetiseerd door het enzym primase. Primase begint een complementaire
RNA keten met een enkele RNA nucleotide en bindt één RNA nucleotide tegelijk door de ouderlijke
DNA streng te gebruiken als template. Een complete primer, vaak 5 tot 10 nucleotiden lang, wordt
gebasepared met de template streng. DNA polymerase enzymen katalyseren de synthese van nieuw
DNA door nucleotiden aan het 3’ einde toe te voegen van de bestaande keten.
Primase: synthetizeerd RNA primers en gebruiken het ouderlijk DNA als template.
Topoisomerase: breekt, draait en herbindt het ouderlijk DNA
voor de replicatievork, waardoor het de spanning verlicht die
veroorzaakt wordt bij het ontwinden.
Helicase: ontwindt en scheidt de ouderlijke DNA strengen.
Single-strand binding proteins: stabilizeren de afgewikkelde
ouderlijke strengen.
De leading strand wordt doorlopend gesynthetizeerd in de 5’
naar 3’ directie door DNA polymerase III.
Primase begint de synthese van de RNA primer voor het vijfde Okazaki fragment.
DNA polymerase III voltooid de synthese van fragment 4. Als het de DNA primer van fragment 3
bereikt, maakt het zich los en begint DNA nucleotiden toe te voegen aan het 3’ einde van de primer
van fragment 5 in de replicatie vork.
DNA polymerase I verwijderd de primer van het 5’ einde van fragment 2, en verwisselt het met DNA
nucleotiden die één voor één toegevoegd worden aan het 3’ einde van fragment 3. Na de laatste
, toevoeging heeft de ‘backbone’ een vrij 3’ einde. DNA ligase bindt het 3’ einde van fragment 2 aan
het 5’ einde van fragment 1.
DNA synthese
Oligonucleotides:
• Primers (enkelstrengs rond 18-25 nucleotiden)
• Adapters (dubbelstrengs rond 18-25 nucleotiden)
• Probes (enkelstrengs ong. 100-1000 nucleotiden)
‘Zelf’ DNA kopiëren
DNA kopiëren kan zowel in vitro als in vivo:
- In vitro: PCR (Polymerase Chain Reaction)
- In vivo: Gene cloning (HC2)
PCR is niet geschikt voor bijvoorbeeld hele chromosomen,
maar stukken DNA van 100-1500 nucleotiden. De kopieën die
je maakt zijn niet willekeurig maar doelgericht op een
specifiek stukje DNA, de doelsequentie. De keuze van je
primers bepaald welk stukje DNA je amplificeert (kopieert).
DNA amplificatie: de Polymerase Chain Reaction (PCR)
Bij PCR worden veel kopieën gemaakt van een specifiek stukje
DNA. In de PCR procedure zorgt een cyclus van 3 stappen voor
een kettingreactie die een exponentieel groeiende populatie van identieke DNA moleculen
produceert.
1. Denaturation: het reactie mengsel wordt verhit op hoge temperaturen om de DNA strengen
van het dubbelgestrengde DNA te scheiden. De waterstofbruggen verbreken, en de strengen
komen los van elkaar.
2. Annealing: het mengsel wordt afgekoeld waardoor primers waterstofbruggen kunnen
vormen met de einden van target sequenties. De primers binden aan de strengen, hier is een
specifieke temperatuur voor nodig.
3. Extension: DNA polymerase bindt nucleotiden aan het 3’ einde van elke primer, in de 5’ -> 3’
richting.
Meerdere cycli zorgen voor meerdere producten. Dit gaat exponentieel door omdat het product uit
cyclus 1 het uitgangsmateriaal is voor cyclus 2.
Voor PCR is dubbelstrengs DNA die twee target sequenties bevatten, een hittebestendige DNA
polymerase, alle vier de nucleotiden en twee 15- to 20-nucleotide enkelstrengse DNA strengen die
als primer functioneren nodig. Eén primer is complementair aan de ene streng van de target
sequentie, de tweede primer aan het andere eind van de andere target sequentie.
PCR ingrediënten
PCR ingrediënten:
• DNA (met het target DNA): bevat het target DNA dat gekopieerd wordt.
• Water: wordt gebruikt om het gezuiverde DNA uit het chromatine te verdunnen.
• Zout-buffer: de buffer zorgt voor de optimale omstandigheden voor de DNA-polymerase.
• dNTP’s (nucleotiden): de dNTP mix bevat de bouwstenen voor de DNA-synthese.
• Primers (forward en reverse): deze korte sequentie van nucleotiden zorgt voor het startpunt
voor DNA synthese. Bij PCR bepalen de primers het stuk DNA dat gekopieerd, of
geamplifeerd wordt, doordat ze aan specifieke stukken binden.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller dewithnicolien. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $8.64. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67096 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now