Summary
Samenvatting farmaceutische biotechnologie : biotechnologische productiemethoden
- Course
- Institution
Dit is een samenvatting van het hoofdstuk biotechnologische productiemethoden van het vak farmaceutische biotechnologie.
[Show more]
Seller
Follow
Mertj
Reviews received
Content preview
DEEL 1 : BIOTECHNOLOGISCHE PRODUCTIEMETHODEN1. Biotechnologisch gebruik van genetisch ongewijzigde micro-organismen
Productie van biomassa door micro-organismen = FERMENTATIE
Kweek in een reactietank (fermentor) :
Micro-org. er in met minimaal voedingsmilieu/groeimedium
- C-bron (bv glucose) → ATP
- N-bron (bv ammonium) → aminozuren aanmaken
- Zouten en sportenelementen → belang bij optimale groei
Deze fermentoren zijn kleiner voor research maar kunnen tot duizenden liters zijn in de
industrie
Fermentatie processen
Batch proces (meest eenvoudige)
- Fermentor + groeimed. + micro-org. → fermentatie tot een gewenst punt
bereikt is (bv celdensiteit, concentratie,…)
- Inhoud van tank verwijderd en eindproduct geïsoleerd
Continue proces
- Na toevoegen micro-org. continue vers medium/nutriënten toevoegen &
reactiemengsel (micro-org. en product) wordt afgetapt
- Handig voor bv micro-org. die moeilijk groeien
Continue proces met celrecylcering
- Reactiemengsel ook afvoeren maar de cellen/micro-org. afscheiden en
recycleren
- Langere fermentatie (dagen)
Gebruikte micro-organismen
Doorgaans GRAS (generally recognized as safe-) organismen
Bacteriën : bv Bacillus, Streptomyces
Schimmels : bv Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus
Gisten : bv Saccharomyces cerevisiae
GRAS-organismen zijn :
Niet pathogeen
Niet toxisch
Produceren meestal geen antibiotica
➔ Veilige productie van het gewenste eindproduct
Eindproducten
Enzymen, eenvoudige organische chemicaliën, geur-en smaakstoffen, polysachariden,
antibiotica, aminozuren enz.
,2. Recombinant DNA technologie
2.1 Inleiding
Structuur DNA en RNA
→ zie ppt (pagina 9-12)
mRNA synthese
Transcriptie = omzetting van DNA in boodschapper RNA (messenger RNA, mRNa)
Zeer selectief : in zoogdiercellen wordt slechts 1% van het DNA omgezet in mRNA
DNA afhankelijk RNA POLYMERASE enzyme bindt op een promoter en synthetiseert een RNA
streng van 5’ naar 3’ richting tot aan een stopsignaal
3 RNA polumerasen in eukaryoten
- RNA polymerase 1 : grote ribosomale RNAs
- RNA polymerase 2 : aanmaak mRNA
- RNA polymerase 3 : kleine stabiele RNAs waaronder tRNA
mRNA’s worden gedurende de aanmaak gemodificeerd aan 5’ en 3’ einde om hun te
onderscheiden van de RNAs gemaakt door de andere polymerasen en zo aan te geven dat
deze omgezet moeten worden in proteïnen.
het 5’ einde wordt ge-capped doortoevoeging van een gemethyleerd G nucleotide. Dit
gebeurt vrijwel onmiddellijk
Dit is een 5’-5’ binding. Men gaat ervan uit dat een deel van de nodige enzymen gebonden zit
op het polymerase II.
Deze 5’ cap zal een belangrijke rol spelen bij de eiwitsynthese (soort herkenning) en zou ook
het RNA beschermen tegen degradatie.
Polyadenylatie van mRNA aan 3’ einde
- Herkenning van een polyadenylatiesignaal (AAUAAA) in het transcript door specifieke
RNA-bindende eiwitten
→ stopt transcriptie
→ klieving transcript door endonuclease
- Poly A polymerase voegt een staart van ~250 A’s toe aan het 3’ einde
,2.2 Isolaties
2.2.1 Isolatie genomisch DNA
DNA isolatie met behulp van commercieel verkrijgbare DNA isolatiekits
Werkwijze
Isolatie cellen of weefsel
Lyse van cellen in een lyse-oplossing
- Bacteriën
Cellen suspenderen in buffer met lysozyme (breekt
peptidoglycaanlaag en dus celwand af) , Triton X-100 (lost
membranen op) en RNase A (breekt RNA af) (37°C, 30min)
Buffer met guanidine HCl (eiwitten denatureren) en proteinase K
(eiwitten afbreken) toevoegen (50°C , 30min)
- Gisten
Cellen suspenderen in buffer met lyticase (geen lysozyme want gwn
peptidoglycaan) , Triton X-100 en RNase A (30°C , 30min)
Buffer met guanidine HCl en proteinase K toevoegen (50°C , 30min)
- Dierlijke cellen (geen celwand)
Cellen suspenderen in buffer met Triton X-100 en RNase A (10 min
op ijs) ijs want bij openbreken cellen ku DNasen vrijkomen, we willen
dit remmen en DNA intact houden
Buffer met guanidine HCl en proteinase K toevoegen (50°C , 30min)
Binding DNA op een matrix met positief geladen diethyl aminoethyl (DEAE)
groepen (DNA is negatief geladen)
Was van DEAE-matrix met medium-zout concentraties (0,75-1M NaCl) (niet
gebonden materiaal wegspoelen)
Elutie DNA van DEAE in hoog zout (>1,25M NaCl)
Precipitatie DNA met isopropanol of ethanol (een alcohol-zout combinatie laat
DNA neerslaan, dan centrifugeren en oplossen in andere buffer bv water)
, DNA isolatie met behulp van silica membranen
Eigenschappen
Silica (siliciumoxide) gebaseerd materiaal
Selectieve adsorptie van DNA
Omgekeerde van daarnet DNA binding onder hoge zoutconcentraties
DNA elutie onder lage zoutconcentraties
Geen organische of toxische reagentia
Geen alcohol precipitatie
Binding DNA op silica
In hoge zoutconcentraties
- Een chaotroop zout (bv guanidine HCl) zal de watermantel rond silica
verstoren
- Na+ ionen vormen een zoutbrug tussen de negatief geladen silica en de
fosfaatgroepen op DNA
In lage zoutconcentraties
- Rehydratatie van de silica matrix verbreekt de binding met DNA
2.2.2 RNA isolatie
Methode 1 : extractie met organische solventen
Zure fenol/chloroform/isoamylalcohol (pH<6 anders DNA ook in waterige fase)
toevoegen aan cellysaat
Emulsie maken door vortexen
Centrifugeer tot 3 fasen
Neem waterige fase en precipiteer RNA met isopropanol
Methode 2 : solid-phase extractie met silica
Isolatie cellen of weefsel
Lyse van cellen in een lyse-oplossing (met guanidine thiocyanaat) → krachtige
RNase remmer dus inactiveert
Binding RNA op silica matrix
Wassen gebonden RNA
Elutie RNA van silica
Vaak voegt men DNasen toe zodat DNA niet gaat binden
Knelpunt bij RNA isolaties : snelle afbraak van RNA door stabiele RNases
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller Mertj. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $11.26. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
67474 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now