Summary
GESLAAGD IN 1e ZIT. Samenvatting inleiding tot biotechnologie en genetica
- Course
- Institution
Geslaagd in 1e zit 17/20 met behulp van deze complete samenvatting.
[Show more]
Seller
Follow
eloisevnn
Reviews received
Content preview
Inleiding tot biotechnologie & geneticaInhoudsopgave
1 Inleiding: biotechnologie ........................................................................................... 3
2 Basisbegrippen/technieken in biotechnologie & genetica ........................................... 7
2.1 DNA-RNA ..................................................................................................................... 7
2.1.1 dna-structuur .................................................................................................................................. 7
2.1.2 denaturatie – renaturatie ................................................................................................................ 8
2.1.3 DNA-replicatie ............................................................................................................................... 11
2.2 De “polymerase chain reaction”: PCR .......................................................................... 15
2.2.1 principe van de pcr-reactie ............................................................................................................ 15
2.2.2 chemische synthese van dna ......................................................................................................... 18
2.2.3 uitvoering van de pcr reactie ......................................................................................................... 23
2.2.4 Taq polymerase ............................................................................................................................. 26
2.2.5 oorsprong van dna voor de PCR reactie ........................................................................................ 27
2.2.6 gebruik pcr (toepassingen) ............................................................................................................ 27
2.3 DNA mutaties en herstelmechanismen........................................................................ 39
2.3.1 DNA mutaties ................................................................................................................................ 39
2.3.2 herstelmechanismen ..................................................................................................................... 43
2.4 DNA sequenering ....................................................................................................... 46
2.4.1 SAnger sequencing ........................................................................................................................ 46
2.4.2 cycle-sequencing ........................................................................................................................... 49
2.4.3 NGS – next generation sequencing ............................................................................................... 52
2.5 Restrictie enzymen (RE) .............................................................................................. 53
2.5.1 DNA ligase ..................................................................................................................................... 54
2.5.2 restrictiemappen ........................................................................................................................... 55
2.6 Isolatie van een gen .................................................................................................... 56
2.6.1 belangrijkste methode (isolatie gen) ............................................................................................. 56
2.6.2 alternatief: synthetisch aanmaken ................................................................................................ 58
2.6.3 geïsoleerd mrna cdna ............................................................................................................... 59
2.6.4 cdna in plasmide brengen ............................................................................................................. 60
2.6.5 reverse trancriptase gelinkt aan polymerase chain reactie (RT-PCR) ............................................ 64
3 De eukaryote celkern ............................................................................................... 67
3.1 De eukaryote cel en haar celkern ................................................................................ 67
3.2 Structuur vh chromosoom .......................................................................................... 69
3.2.1 chromosomale eiwitten / opvouwing DNA ................................................................................... 70
3.2.2 telomeren ...................................................................................................................................... 72
4 RNA & transcriptie................................................................................................... 74
4.1 Transcriptie in PROKARYOTEN ..................................................................................... 74
4.1.1 transcritpie (prokaryoten) ............................................................................................................. 74
4.1.2 RNA polymerase (prokaryoten) ..................................................................................................... 75
4.1.3 initiatie (prokaryoten) ................................................................................................................... 76
4.2 Transcriptie in EUKARYOTEN ....................................................................................... 77
4.2.1 rna-polymerase (eukaryoten) ........................................................................................................ 78
1
, 4.3 tRNA .......................................................................................................................... 79
4.3.1 structuur trna ................................................................................................................................ 79
4.3.2 genetische code = degeneratief .................................................................................................... 80
4.3.3 koppeling az (met trna) ................................................................................................................. 81
4.4 rRNA & de ribosomen ................................................................................................. 82
4.4.1 rRNas + ribosomale EW ribosomen .......................................................................................... 84
4.5 mRNA ........................................................................................................................ 86
4.5.1 modificaties mRNA (eukaryoten) .................................................................................................. 87
4.5.2 einde eukaryotisch mRNA ............................................................................................................. 88
4.6 Splicing ...................................................................................................................... 90
4.6.1 splicing door spliceosoom ............................................................................................................. 92
5 Eiwitten & de translatie ........................................................................................... 93
5.1 Eiwitten – inleiding ..................................................................................................... 93
5.2 Eiwitsynthese ............................................................................................................. 93
5.2.1 eiwitsynthese bij PROKARYOTEN .................................................................................................. 93
5.2.2 eiwitsynthese bij eukaryoten ...................................................................................................... 100
5.3 De genetische code....................................................................................................102
5.4 Genregulatie in bacteriën (PROKARYOTEN) ................................................................102
5.4.1 induceerbare genen .................................................................................................................... 103
5.5 Genregulatie bij EUKARYOTEN ...................................................................................105
6 Recombinant DNA ..................................................................................................107
6.1 Plasmide klonerings vectoren ....................................................................................107
6.1.1 F plasmiden ................................................................................................................................. 108
6.1.2 R plasmiden ................................................................................................................................. 109
6.1.3 eigenschappen plasmide kloneringsvectoren ............................................................................. 110
6.1.4 voorbeelde plasmide kloneringsvectoren ................................................................................... 110
6.2 Faagvectoren.............................................................................................................117
6.3 Cosmide vectoren ......................................................................................................120
2
,1 Inleiding: biotechnologie
Gebruik & manipulatie v biologische syst ter (industriële) bereiding v natuurlijke
grondstoffen & biomassa
Biologische systemen: micro-org, plantaardige/ dierlijke cellen, enzymen geïsoleerd uit
levende wezens
NIET: traditionele agricultuur & veeteelt
• Kruisen planten & dieren zonder genetische manipulatie ≠ biotech
mRNA vaccins = geen klassiek biotech prod (want w niet aangemaakt in levende cellen)
Biotech prod?
• Niet zozeer: wat is product?
• Maar: hoe w prod aangemaakt?
▪ Synthetisch geen biotech prod
Biotech prod: potentieel gecontamineerd met vb virussen
Onderscheid GM’en:
▪ Aangemaakt via chemische synthese
▪ Aangemaakt via biotech processen/ rechtstreeks biologisch
EERSTE PERIODE
Biologische systemen reeds 1000’en jaren gebruikt
• Tijdperk: op onbewuste wijze gebruik gemaakt v bacteriën & gisten:
▪ Productie levensmiddelen: bier, wijn, kaas, yoghurt, azijn
▪ Eindigt +-1850: L.Pasteur micro-organismen verantwoordelijk vr
bepaalde omzettingen (suikers => alcohol, verzuring wijn)
• Zo: kon bewust gebruik maken v biologische systemen
• Maar: techniek om contaminaties met vreemde org nog niet
gekend (vreemde org op spontane wijze contaminatie)
• Wijn: als in druivensap verkeerde micro-org wijnazijn ipv wijn (suikers azijn
ipv alcohol)
▪ Na Pasteur: doelbewust gisten selecteren wijn
Bier brouwen:
• Relatief gecontroleerde manier vr gebruik micro-organismen & gisten
• Omkoken: micro-org die spontaan aanwezig zijn, w afgedood
• Fermentatie: door toevoegen v geselecteerde gisten => prod alcohol + CO2
• Als alle suikers => alcohol gisten breken af
• Alcohol = toxisch vr gisten gisten breken af (daarom bier max 13% alc)
• !! toevallige micro-org groeien er bij (toevallige contaminatie) !!
3
,TWEEDE PERIODE
Start: na ontdekking L. Pasteur
Introductie industriële processen om grote hoeveelheden glycol, butanol, aceton & CZ
aan te maken + start massaproductie bakkersgist + biologische zuiveringsinstallaties rond
grote steden
• Niet verhinderd door vreemde micro-organismen (niet eigen aan prod)
DERDE PERIODE
Kennis & gebruik aseptische technieken (= om zaken steriel te doen) (niet makkelijk!) =>
zuivere culturen => farmaceutische prod penicillines
Farmaceutische prod: ALLES moet STERIEL zijn (= 0 micro-organismen aanwezig!)
(<-> andere biotech prod: steriliteit niet zo belangr vb waspoeder)
Sindsdien: metabolieten v tal v micro-org beschreven & geprod
Biologisch product: geïsoleerd uit levende organismen zonder (genetische) manipulatie
Biotechnologisch product: deel v biologisch prod manipulatie
Recombinante biotechnologisch product: biotech prod DNA manipulatie
VIERDE PERIODE
Start: invoer recombinant DNA-technieken & definiteive doorbraak v plantaardige &
dierlijke celculturen in productieprocessen (1970-1980)
Biotech = veel meer dan DNA-manipulaties
• Biotech <-> DNA-manipulaties: geen synoniemen !!
Farmaceutische sector: noodzaak aan massaprod v oraal werkzame antimicrobiële
stoffen => ontwikkeling v kiemverbetering & industriële aseptische technieken
• + introductie gebruik dierlijke celculturen in productieproces v vaccins
Recombinant DNA-technieken = genetic engineering
• = doorbraak in mogelijkheden farmaceutische nijverheid
DNA manipuleren + (stabiele) wijziging al dan niet in genoom v bepaalde cellen
(bacteriezoogdiercel)
• Recombinante proteïnen aanmaken op industriële schaal
• Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
▪ Zo: bepaalde:
• Neuro-endocriene boodschappers (FSH, LH, EGD, insuline,
erythropoietine, enkefaline,..),
• Lymfokines (communicatiemol tss cellen v afweermechanisme, vb
interferons, interleukines,…)
• Bloedproteïnen (stollingsfactoren, trombolytica,
proteaseinhibitoren)
▪ … kunnen wereldwijd klinisch getest w & therapeutisch gebruikt w
Ook recombinante technieken voor: vaccins, mAb (monoklonale anti-lichamen), enzymen
Gewone biologicals: bloed-afgeleide producten (biologische prod) (geen biotech prod)
Biotech producten: door manipulatie v micro-org, maar zonder wijzigingen DNA
Recombinant: DNA manipulatie, vb insuline
4
, Insuline:
• Normaal in lichaam: in beperkt # cellen gemaakt (alleen in beta-cellen pancreas)
• Gen vr coderen insuline: wel overal
▪ Genoom in hele lichaam zelfde, maar cellen doen versch dingen
▪ Uit-/aanzetten v promotoren (afh v omgevingsfactoren): bepaalt wat
cellen doen
• Startcodon codeert vr Methionine EW beginnen met Met
• Aanmaak insuline: EW start niet met Met
▪ Door post-translationele modificaties stuk v EW weg (signaalsequentie
afgeknipt)
• Varkensinsuline verschilt maar 1 AZ met menselijk
▪ Vroeger bij diabetes
▪ 1 AZ verschil = genoeg om als lichaamsvreemd EW herkend te w
• Patiënt maakt antilichamen aan tg varkensinsuline resistentie
werkt niet meer
Analyse vd nieuwe biogene GM’en = extreem belangrijk, kwaliteitscontrole (uitdaging)
• Risico op contaminatie (virussen,..)
▪ Strikte in procescontroles (strengere kwaliteitscontroles) + analyses
• EW’en = complexer dan klassieke GM
▪ Analyse veel moeilijker
▪ Moeilijkere prod’en om mee om te gaan
5
, mAb: monochromaal anti-lichaam
Structuur v opvouwen = moeilijk te bepalen + niet zo stabiel
GM’en in frigo/diepvries: gn denaturatie (= irreversibel !!)
• Als GM gedenatureerd is kan niet terug
6
,2 Basisbegrippen/technieken in biotechnologie & genetica
2.1 DNA-RNA
2.1.1 DNA-STRUCTUUR
Primaire struct: polynucleotide-struct
• Polynucleotide: door vorming 3’-5’-fosfordiëster verbinding tss nucleotiden
▪ Suiker-fosfaatskelet
▪ Basen op skelet gebonden via koolstof 1’ v suikermolecule (bepalen DNA-
sequentie)
Secundaire struct: 2 anti-parallelle ketens
• = Watson & Crick model
• Dubbelstrengig
▪ Uitz: vr enkele virussen met enkelstrengig DNA
• 1 streng in 5’3’ richtinhg, andere in 3’5’ richting (anti-
parallel)
• Ketens samengehouden door H-bruggen tss complementaire
basen (basepaarvorming): A-T & G-C
▪ Chargaffregel:
𝐴+𝐺 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑛𝑒𝑠
= =1
𝐶+𝑇 𝑝𝑦𝑟𝑖𝑚𝑖𝑑𝑖𝑛𝑒𝑠
Veel virussen: enkelstrengig DNA-genoom
• Gebieden v complementariteit met zichzelf —> interne dubbel helix haarspeld
structuren
1 enkele streng bubbels: DNA blijft enkelstrengig omdat
intern opgeplooid niet intern complementair is (daar)
7
, Veel genomen = circulaire DNA moleculen
• Oa met meeste (/alle) bacteriële genomen, sommige virussen, versch
bacteriofagen & plasmiden
• In bacterie: al het DNA dat je er kan uithalen = circulaire DNA-moleculen
• Voordeel circulaire genomen:
▪ Om te kunnen delen: moeten eerst DNA kunnen verdubbelen
(2 dochtercellen)
▪ Bij circulair DNA: replicatieproces eenvoudiger
▪ <-> mens (zoogdieren): lineair DNA
• Plasmiden: maken niet per se deel uit v genoom!
▪ Kan zelfde bacterie hebben met/zonder plasmiden OF met versch
plasmiden
2.1.2 DENATURATIE – RENATURATIE
Denaturatie (eiwitten)
• Vb ei koken: vl vast
▪ EW’en verliezen originele struct
▪ irreversibel
Denaturatie (DNA)
• Reversibel !!!
▪ Kan renatureren (strengen weer samen)
▪ Kan je onbeperkt herhalen
• Invloeden denaturatie – renaturatie:
▪ Thermisch (verwarmen)
▪ pH wijziging (sterk Z/B)
➢ !! in te sterk Z/B milieu: DNA breekt af
▪ Destabilisatie met ureum, formamide
Tm waarde/ smelttemp (melting temperature)
• = temp waarbij ½ v basen in duplex ongepaard zijn ( ½ enkelstrengig)
• [G] [C] gehalte , Tm
▪ [G]-[C]: 3 H-bruggen ipv 2 bij [A]-[T]
➢ Betere binding stabielere binding moet meer E toevoegen om
te bteken
• Vnl belangr bij renaturatie afkoelen tot Tm waarde
▪ Als je voll gerenatureerd DNA wil: afkoelen tot ong 25°C onder Tm
Renaturatie:
• Gedenatureerde strengen die geïncubeerd w bij temp die ong 25°C onder Tm
waarde ligt gaan reassociëren
8
, Meting/detectie v denaturatie: door UV-spectrofotometrie
• Dubbelstrengig DNA: absorbeert minder UV bij 260 nm dan enkelstrengig DNA
denaturatieproces kan gevolgd w (want basen bij dubbel streng meer verborgen -
> kunnen minder licht absorberen)
Poly d(A-T)
• Enkel uit A & T (2 H-bruggen)
• Tot ong 60°C: A blijft zelfde verder: A (zonder iets toe te voegen) w
enkelstrengig
• Tm ong 70°C
▪ Op helft curve
▪ ½ enkelstrengig, ½ dubbelstrengig
DNA
• Tm ong 80°C
▪ Als je voll denaturatie wil: stuk boven 80°C
▪ Als je voll renaturatie wil: stuk onder 80°C
• Alle DNA uit org halen = gedenatureerd???
9
, UV-spectrometrie (Lambert-Beer)
• Schatting hoeveelheid DNA
• Schatting zuiverheid DNA
Hoeveelheid DNA:
• 1 OD260nm (OD = optimale densiteit)
▪ = +- 50 µg/ml dubbelstrengig DNA
▪ = +- 33 µg/ml enkelstrengig DNA
Zuiverheid DNA
• In zuivere DNA prepraties:
Verhouding OD260/OD280 = 1.8
VRAGEN:
1) stel verhouding = 1,5 (<1,8) DNA = onzuiver
2) stel verhouding = 2,2 (> 1,8) DNA = onzuiver
➔ zuiver DNA: verhouding = 1,8 (niet meer/minder) (niet “zeer zuiver”)
➔ als absorbantie groter/kleiner dan 1,8: door andere stoffen bij DNA die aborbantie-
spectrum beïnvloeden (verstoren verhouding)
3) stel verhouding = 1,8 weet niet zeker of DNA zuiver is !!
➔ kan nog andere stof in zitten met ong dezelfde verhouding v absorbantie
➔ OF 2 versch onzuiverheden ene absorbeert meer, andere minder verh = 1,8
10
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller eloisevnn. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $21.99. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
72042 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now