Uitgebreide samenvatting van de lessen Methoden in het biomedisch onderzoek gegeven door Johan Swinnen, Dirk Daelemans en Kim de Keersmaker. Punt behaald met deze samenvatting: 15/20. De samenvatting is 149 pagina's
HOOFDSTUK 2: DNA
2.1. DNA SEQUENTIEBEPALING
Evolutie in methoden:
First-generation sequencing (1977)
• Sanger, (Maxam and Gilbert)
• cloneren (plasmiden - bacteriën)
• elektroforese
• nog steeds “gouden standaard”, voor kleine projecten
Second-generation sequencing
• ‘next-generation sequencing’ (2006-…)
• massief parallel sequencen van clonaal in vitro geamplificeerde DNA moleculen
• miljoenen korte sequenties tegelijk
• bv. Illumina, Ion Torrent
Third-generation sequencing
“next-next generation sequencing” (2010-…)
• sequencing van individuele DNA moleculen (geen amplificatie)
• bv. Nanopore, Pacific Biosciences
Evolutie in capaciteit, snelheid en kosten
Brede toepassingen:
De novo genoom sequentiebepaling = sequentie van een species waar we nog geen DNA sequentie van hebben
• ongekende genomen bv Humaan Genoom project
• nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
• gedeeltelijk of volledig
SANGER SEQUENCING = NIEUWSYNTHESE MET DIDEOXY -KETEN TERMINATIE
• template/matrijs = clone of PCR amplicon bv van genomisch DNA-fragment
• polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met verschillende fluorescente
label)
• reactie loopt door na inbouwen dNTP
• reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
• Normale dNTP: 2’OH groep ontbreekt, bij ddNTP: ook 3’ OH groep ontbreekt, dat is de OH groep die
fosfodiesterverbindingen gaat vormen in een DNA keten
• juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
• scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram
• beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen
• voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties
(FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
ELEKTROFEROGRAM AFLEZEN
Phred score Q = -10*log10(P)
P = probabiliteit van foutieve base call
1ste 30 bp niet afleesbaar
meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede sequentie afleesbaar
Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base (Phred-score)
,MUTATIEDETECTIE
- Niet altijd even hoge pieken
- sequentie-fout versus mutatie? → forward en reverse
reacties ter bevestiging
VERWEZENLIJKINGEN MET 1 E GENERATIE SEQUENCING (SANGER)
Human Genome Project (HGP)
= grootste multinationale biologische project ooit
3 billion USD
• gestart 1990, geleid door Francis Collins, NIH
• stalen: meerdere anonieme individuen
• methode: hierarchical shotgun sequencing met Sanger methode
• clones in YACs, BACs, P1s, cosmiden
• mapping en fragmentation (5 jaar)
→ automatische sample bereiding en sequentiebepaling door 20 centers over heel de wereld (100-
den toestellen)
→ elke 24u publieke vrijgave sequenties
→ draft sequentie 2001, finale sequentie 2003
ENORME IMPACT OP:
• technologische ontwikkeling van sequencing
automatisering,…
→ gedaalde kosten/base (van € 10/b → € 0.01 /b)
→ enorme toename in sequentiedata
aanpak: bv sommige delen van chromosoom zoals centromeren bijna onmogelijk te cloneren
• grote ontwikkeling van bioinformatica
• visie op delen van data (open science, open data)
• andere methoden omdat nu de (bijna) volledige sequentie beschikbaar is
• biologische kennis:
▪ sequentie en organisatie van nagenoeg alle humane genen gekend
▪ vergelijkende genomics: inzicht in evolutie, in geconserveerde processen
▪ genetische verschillen tussen mensen
NIEUWE UITDAGINGEN:
• volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
• meer genomen sequencen van meerdere species
• meer individuele humane sequenties
• persoonlijke genoomsequentie van iedereen
, Enorme mogelijkheden voor ‘personalizes precision medicine’
• Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose, preventie
• Farmacogenomics: verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed/slecht reageren op
geneesmiddelen → enorme impact op industrie
• Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen (diabetes, kanker,..)
• Therapie op maat, bv al bij kanker
• Maar ook ethische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschappijen
2.1.2. 2 D E GENERATIE SEQUENTIEBEPALING: SHORT -READ NEXT-GENERATION SEQUENCING
doel: veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA sequentiebepaling mogelijk
richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000 USD (“thousand-dollar genome”)
Ontwikkeling van nieuwe technologie met 3 pijlers:
• parallelle detectie (Massive parallel sequencing)
o cluster of polony = kopieën van een DNA template
o klonale in vitro amplificatie van template (<> klassieke klonering)
→ duizenden-miljoenen kopieën van DNA template per cluster
o multiplexing: vele clusters tegelijk (<> 1 template/reactie)
• miniaturisatie van reacties => werken in super kleine putjes
• integratie van het proces (pipeline)
o directe detectie (<> scheiding fragmenten via gelelectroforese
Verschillende commerciele platformen:
• 454/Roche, Illumina, SOLID, Ion Torrent,..
• Zeer competitief
• Snelle evolutie
Gebaseerd op 4 stappen:
• Stap1. Aanmaak DNA library
• Stap 2. Klonale in vitro amplificatie
• Stap 3. Sequencing/sequentiebepaling
• Stap 4. Data analyse
STAP 1: AANMAAK NGS DNA LIBRARY
library = fragmentenbank = verzameling te sequencen templates
afhankelijk van doelstelling kunnen we verschillende soorten librarys maken
Types DNA library:
• whole genome sequencing (WGS)
• Mate Pair libraries (zie verder): 2 uiteindes van fragment met gekende afstand ertussen
• whole exome sequencing (WES) of targeted sequencing:
aanrijking door hybridisatie aan probes (in oplossing of op array) (zie panel A) of PCR-gebaseerd (zie
panel B)
o DNA fragmenten met de gewenste sequentie blijven plakken => enkel de gewenste blijven
plakken en de rest dan wegwassen
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller elisabaetens. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $17.88. You're not tied to anything after your purchase.
