Summary
samenvatting moleculaire biologie en DNA-technologie
- Course
- Institution
samenvatting moleculaire biologie en DNA-technologie 2de jaar, 1ste semester
[Show more]
Seller
Follow
amber50
Reviews received
Content preview
Moleculaire biologie en DNA-technologieHoofdstuk 1: isolatie van nucleïnezuren
1. Structuur DNA
DNA bestaat uit:
2 antiparallelle strengen; gebonden door H-bruggen
Een 5’ uiteinde met een fosfaatgroep
Een 3’ uiteinde met een OH-groep
Bestaat uit 4 verschillende nucleïnezuren: A, G, T en C
2. Structuur RNA
= zelfde primaire structuur als DNA maar heeft een OH op 2’
Reactiever en minder stabiel dan DNA
RNA kan secundaire structuren vormen door lussen/loops te maken
(bv. Hairpin)
Waarom isolatie DNA nodig?
Enzymwerking wordt verstoord bij onzuiver DNA
Zuiver DNA nodig voor downstream
1. Lyseren (=stap 1); het openbreken van cellen om aan DNA te
kunnen
Methode is afhankelijk van het staaltype, er zijn meerdere soorten
weefsels en cellen die allemaal anders behandelt moeten worden
1.1 Mogelijkheden om cellen open te breken om DNA te isoleren
Chemische:
Detergent (SDS = vorming van micellen)
Alkalische buffer (NaOH)
Biologisch:
a.d.h.v enzymen; de meest voorkomende is Proteïnase K in de
humane cel
Proteïnase K Eigenschappen
= een enzym die eiwitten (in - Breed-spectrum
celmembraan en op - Knipt na hydrofobe
nucleïnezuren) en nucleasen groepen
afbreekt - Degradeert eiwitten
- Kan nucleasen
onschadelijk maken
- Verkiest 60° en pH = 7-9
,Toevoeging SDS(=detergent) of chaotrope stoffen = ze denatureren
het substraat waardoor het toegankelijker wordt voor het enzym =
activiteit
En lysozyme als enzym bij de bacteriën = hydrolyseert
peptidoglycaan
Gram positieve Gram negatieve
Dikke laag peptidoglycaan Een dunne laag peptidoglycaan
= kan makkelijker Met daarrond een extra
gehydrolyseert worden memebraan -> moeilijker te
hydrolyseren
Fysisch
Druk, temperatuur, straling
Mechanisch
Door beweging: vortexen of soniceren; met geluidsgolven
Combinatie van methodes
Bijvoorbeeld een lysebuffer = detergent en proteïnase K en een
chaotroop agens
1.2 Chaotroop agens
= (bv. SDS, ureum, fenol) verhoogt entropie in een biologisch
systeem door te interfereren met zwakken intermoleculaire krachten
zoals waterstofbruggen, vanderwaalskrachten, hydrofobe effecten=
neiging van niet polaire moleculen om samen te hangen en H2O uit
te sluiten
Functies op biomoleculen:
Verbreekt H20 mantel rond DNA
Denatureert eiwitten
Inactiveert nucleasen = bescherming DNA
Verhoogt membraanpermeabiliteit door verstoring hydrofoob
effect
(! Te kennen buffers = zie document op chamilo!)
1.3 Algemeen: hoe worden de cellen opengebroken in verschillende
organismen?
Humane cellen Bacteriën
Opengebroken door Opengebroken door NaOH
Proteïnase K + detergent + en warmte + lysozyme
warmte
, 2. Het zuiveren van het gelyseerde DNA (= stap 2)
Reden? Zuiver DNA kan beter deelnemen aan reacties
Cellysaat = de substantie verkregen na cellyse, bestaat uit:
DNA in waterige oplossing
RNA in waterige oplossing
Afbraakmaterialen van de cel
Detergenten, proteïnase K en chaotroop agens
Vroeger Nu
Fenol-chloroform extractie Kolomchromotografie of boom-
Gouden standaard extractie
maar schadelijke
producten
2.1 Fenol-chloroform extractie
Bestaat uit 3 fases
1. Waterige fase: met DNA; afzonderen + koude ethanol en
precipitatie -> pellet drogen en oplossen in neutrale
buffer
2. Interfase: met celdebris; eiwitten
3. Organische fase: met proteïnen en lipiden
De waterige fase wordt op het einde overgebracht in een
ander epje
Voordelen Nadelen
Zeer zuiver DNA Tijdrovend
Goede opbrengst Isopropanol precipitatie
Schadelijke organische
solventen
2.2 Boom extractie of kolomchromotografie
1. Lysaat wordt in een epje gedaan met een silicagel aan de
onderkant
2. Door centrifugeren blijft het DNA achter op de silicagel en de
andere contaminenten niet
Wordt gedaan met behulp van een bindingsbuffer (hoge zout
conc en chaotroop agens)
Functie
Verwijderen watermantel DNA en kolom
Vorming kationbrug tussen negatief DNA en silicakolom
3. De stoffen worden gewassen
, Wordt gedaan met ethanol en hoge zoutconcentratie + lage
pH + ethanol
=> DNA blijft aan kolom en contaminenten worden
weggewassen
4. Je verkrijgt een eluaat; door elutiebuffer: lage
zoutconcentratie en hoge pH
Voordelen Nadelen
Snel
Minder schadelijk
Zuiver en geconcentreerd
DNA
Makkelijk automatiseren
3. Het bewaren van het geïsoleerde DNA (=Stap 3)
3.1 Met een buffer
Dnase-vrij water
TE (Tris-EDTA) buffer
Voordeel: DNA langer stabiel
Nadeel: mogelijks storend voor downstream applicaties
3.2 Temperatuur
Normaal: -20°C
Bewaren voor lange periodes: -80°C
Bij herhaaldelijk in- en uitvriezen: 4°C, dit moet je proberen
vermijden want het lijdt tot vermindering van het DNA
3.3 Bewaren van startmateriaal
Je moet in- en uitvriezen vermijden van zodra het staal klaar is
3.4 Hoeveel startmateriaal?
Aan de hand van de grafiek kan je de maximale hoeveelheid van
startmateriaal afleiden
Te veel = je krijgt minder eindproduct
3.5 RNase tijdens extractie
Zorgt ervoor dat er geen RNA maar enkel DNA terecht komt in
het eluaat
(! Vragen slide 86!)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller amber50. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.04. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
80796 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now