Meten hoeveel INF of IL4 er wordt geproduceerd: lichtrood = IL2,
donkerrood = IL6
Focussen op array (=veelvuldige cytokines)
Alle beats worden toegevoegd aan het celkweekmedium van de t-cel ->
cytokines gaan binden op antilichamen gecoat op microsfeer
Sandwich ELISA: primaire en secundaire antilichamen gaan elk langs
een kant binden op het cytokine -> secundair antilichaam met andere
kleurfluorescentie gelabeld -> maat voor hoeveel cytokine er gebonden
heeft: hoe meer secundair antilichaam gebonden, hoe geler
Detectie van antigenspecifieke T-cellen: intracellulaire cytokinekleuring
Welke obstakels moeten worden overwonnen als we antigenen ook intracellulair willen meten
met de flowcytometer?
1) Celstimulaties op korte termijn: T-cel moet worden getriggerd om geactiveerd te worden:
antigen aanbieden
Polyklonale stimulatie: mitogenen kunnen heel sterk de cel activeren
Specifieke, monoklonale stimulatie: peptides, virussen, bacteriën
2) Snelle secretie van cytokines:
Cel slaagt cytokines niet op in de cel, gaat cytokines uitstoten om snel te kunnen reageren
tegen gevaar (willen we niet, want we willen de cytokines kunnen meten en weten welke
cellen cytokines produceren) eiwittransport blokkeren in cel cellen niet meer in staat
om tot eiwitsecretie over te gaan opstapeling cytokines in cel veel cytokine waarin we
geïnteresserd zijn
Nadeel: beide moleculen zijn toxisch voor de cel afweging maken hoe lang cellen behandelen
zodat cytokine wel gemeten kan worden maar cel niet dood gaat
3) Celfixatie en -permeabilisatie
Cytokines opgestapeld in cel: antilichamen tot bij eiwitten in cel te krijgen -> binden op
antilichamen op cel, geraakt niet zomaar over plasmamembraan celmembraan
permeabiliseren met detergent gaten waardoor antilichamen naar binnen kunnen kan
ook veel uit
eerst cel fixeren: aldehyden: paraformaldehyde zorgt ervoor dat alle structuren in de
cel verbonden is met elkaar en niks naar buiten kan lekken
saponine: gebruiken als je enkel door plasmamembraan wil komen
alcoholen: gebruiken als je ook door kernmembraan wil geraken
Nadelen:
Alle lichtverstrooiingsinformatie van de cel verliezen -> 1 populatie op scatter
Signaal tov achtergrondruis is veel lager: wil niet-gebonden antilichamen wegwassen
-> niet efficïent wegwassen = veel achtergrondfluorescentie
Kan niet goed wegwassen door fixatie meer efficïente wasstappen
Fosfo-specifieke antilichamen
Kijken wanneer pathway in gang wordt gezet: antilichamen
die fosfo-specifiek zijn
Pathway wordt geactiveerd: eiwitten worden
gefosforyleerd Kijken wanneer bv tyrosine kinase is
gefosforyleerd
Cel “signalling”: Ca2+, pH, membraan en mitochondriale potentiaal
Hoe meten we celactivatie (=kortstondige toename calcium) mbv fluorescente merkers?
Algemene eigenschappen Probes voor cellulaire activatie:
Membraanpermeabel: nodig want calcium zit in de cel
Nadeel: makkelijk van binnen naar buiten migreren zorgt voor lekkage -> lading
geven dus gevangen in de cel
Vaak acetomethylesters
Geen compartimentalisatie: probes vrij in cytoplasma
Hydrolyse door intracellulaire esterases
Nadeel: onvolledige hydrolyse + toxische hydrolyse producten
Vlugge respons op transiënte verandering
Geen interferentie met de te sonderen respons of met andere celfuncties
Probes gaan binden met calcium krijgen fluorescente kenmerken calcium stijgt heel snel
cascade andere pathways in gang zetten mag niet blokkeren probe mag niet interfereren met
reactie calcium en acties die calcium in gang zet
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lottehulselmans. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.99. You're not tied to anything after your purchase.
