Gen- en celtechnologie
RECOMBINANTE DNA-
TECHNOLOGIE
1. INLEIDING
Gentechnologie is het gericht aanpassen van genetische informatie door middel van
klassieke kruisingsschema’s of moleculair-biologische technieken.
Een voorbeeld van klassieke kruisingsschema’s zijn inbreedingen van muizen die
allemaal genetische hetzelfde zijn. Hier gaan we niet op in gaan.
Waar we ons vooral op gaan focussen is het genetisch modificeren. Deze techniek
gebeurt veel sneller en is veel gerichter dan inbreeding. Er wordt DNA ingevoerd in een
organisme van eenzelfde of andere soort. Zo bekomt men een transgeen organisme.
Deze techniek is zeer betrouwbaar om echt iets te gaan veranderen in de populatie, dit
door een bepaald allel te gaan verwijderen, toe te voegen of te muteren.
Recombinant DNA = DNA-fragmenten van verschillende origine combineren tot een
samenstelling.
2. BASISMETHODEN IN GEN- EN CELTECHNOLOGIE
Recombinante DNA-technologie is een combinatie van gen- en celtechnologie
Gen: isolatie of amplificatie van het gen, aanpassen of muteren van het gen voor we deze
inbrengen in het organisme, DNA overbrengen naar een vector
Cel: transformatie (in gist) of transfectie (in zoogdiercel) of selectie van gemodificeerde
cellen/organismen
A. GENTECHOLOGIE: isolatie/amplificatie van een gen door PCR
PCR of Polymerase Chain Reaction is een stukje (van 10-50 μl) DNA zeer sterk gaan
amplificeren dankzij een polymerase enzyme.
In minder dan 2 uur, wordt 1 DNA <109 keer gekopieerd.
Cyclus:
i. Denaturatie bij 95°C
ii. Annealing bij 55°C
iii. Extensie bij 72°C
1
,Componenten:
i. DNA-polymerase zoals Taq
Het is een enzym voor selectieve en repeated DNA-amplificatie. Het is
resistent tegen hitte en met of zonder proofreading kan deze fouten
nakijken. Het werkt steeds vertrekkend van 3’ naar 5’ toe. Dit enzym werkt
enkel als er Magnesium aanwezig is.
Proofreading = capaciteit van de polymerase gaan controleren. De
polymerase die dit niet hebben zullen af en toe foutjes ingebouwd hebben.
ii. DNA-template
Deze gebruiken als bron van het stukje DNA dat we willen gaan amplificeren.
iii. Twee primers of oligonucleotides: forward en reverse
Het is een korte oligonucleotide complementair aan target regio. Het zal
binden aan de 3’ kant, dus de open kant van de complementaire primer is 3’.
iv. Vier verschillende dNTPs.
Zijn nodig om het stukje DNA aan te maken.
v. Co-enzym: Mg2+ in buffer
DNA-polymerase heeft deze nodig voor zijn activiteit maar de concentratie
mag niet te hoog zijn want dan zal deze binden met het negatieve DNA.
Polymerase werkt enkel vanaf de 3’ kant.
B. GENTECHNOLOGIE: muteren van een gen door PCR: overlap PCR
Er worden twee aparte PCRs uitgevoerd: één aan de rechtse kant van het PCR-product
en één links. Belangrijk is dat de twee binnenste primers complementair zijn aan
elkaar, zodanig dat je in de volgende stap de twee PCR-producten aan elkaar kan
plakken en zo kan verder opbouwen. Ze bevatten een extra stukje dat niet nodig is
voor de PCR maar ervoor zal zorgen dat ze complementair zijn. Dan ga je twee PCR-
producten denatureren. Hierbij krijg je overlap met de vrije 3’ primer kanten.
Je hebt dus in totaal vier primers nodig.
i. 1 en 4: gewoon de standaard aan de twee uiteinden
ii. 2 en 3: moeten aan elkaar complementair zijn met behulp van dat extra
stukje
Figuur: Overlap PCR. Er wordt een PCR uitgevoerd met de A- en
B-primer en een aparte PCR met de C- en D-primer
2
,Figuur: Resultaat van het overlap PCR. Principe van overlap PCR
is dat je dan een tweede PCR uitvoert. Je bekomt een ligatie-PCR
waarbij je de twee PCR-producten gaat gaan mengen en dan doe
je opnieuw een PCR met enkel de primers A en D. Dit omdat de B
en C primers complementair waren, ze kunnen aan elkaar
worden geplakt. De A en D primers passen hier ook op, zo kan de
polymerase worden gebouwd. Zo wordt het eindresultaat
bekomen.
Figuur: Deletie mutatie met overlap PCR. Je wilt het oranje deel
uit het gen gooien. Primers B en C zijn complementair (te zien
aan hashtags en de cirkels die dienen voor de annealing). Primer
A en D kunnen dan mooi aan elkaar worden geplakt en zo krijg je
het oranje gedeelte kwijt.
3
, Figuur: Puntmutagenese met overlap PCR. Dit is
gemakkelijker aangezien je zeer kleine veranderingen wilt
maken in het gen. Je moet niet werken met ingewikkelde
primers. Je kan gewoon de reverse en forward primers laten
overlappen aangezien ze gedeeltelijk hetzelfde zijn. Daarna
kan je aan 5’-kant van die primer de mutatie aanbrengen die
gewenst is. Zolang het niet de dicht bij de 3’-kant is waar dat
de polymerase gaat gaan werken, vormt dit geen probleem. Je
krijgt twee PCR-amplicons met de mutatie erin en zo kan een
nieuwe PCR-reactie worden uitgevoerd.
Dat kan een heel kleine deletie zijn of een kleine insertie of de
verandering van A naar C zonder dat het interfereert met de
polymerase activiteit van het enzym.
4
RECOMBINANTE DNA-
TECHNOLOGIE
1. INLEIDING
Gentechnologie is het gericht aanpassen van genetische informatie door middel van
klassieke kruisingsschema’s of moleculair-biologische technieken.
Een voorbeeld van klassieke kruisingsschema’s zijn inbreedingen van muizen die
allemaal genetische hetzelfde zijn. Hier gaan we niet op in gaan.
Waar we ons vooral op gaan focussen is het genetisch modificeren. Deze techniek
gebeurt veel sneller en is veel gerichter dan inbreeding. Er wordt DNA ingevoerd in een
organisme van eenzelfde of andere soort. Zo bekomt men een transgeen organisme.
Deze techniek is zeer betrouwbaar om echt iets te gaan veranderen in de populatie, dit
door een bepaald allel te gaan verwijderen, toe te voegen of te muteren.
Recombinant DNA = DNA-fragmenten van verschillende origine combineren tot een
samenstelling.
2. BASISMETHODEN IN GEN- EN CELTECHNOLOGIE
Recombinante DNA-technologie is een combinatie van gen- en celtechnologie
Gen: isolatie of amplificatie van het gen, aanpassen of muteren van het gen voor we deze
inbrengen in het organisme, DNA overbrengen naar een vector
Cel: transformatie (in gist) of transfectie (in zoogdiercel) of selectie van gemodificeerde
cellen/organismen
A. GENTECHOLOGIE: isolatie/amplificatie van een gen door PCR
PCR of Polymerase Chain Reaction is een stukje (van 10-50 μl) DNA zeer sterk gaan
amplificeren dankzij een polymerase enzyme.
In minder dan 2 uur, wordt 1 DNA <109 keer gekopieerd.
Cyclus:
i. Denaturatie bij 95°C
ii. Annealing bij 55°C
iii. Extensie bij 72°C
1
,Componenten:
i. DNA-polymerase zoals Taq
Het is een enzym voor selectieve en repeated DNA-amplificatie. Het is
resistent tegen hitte en met of zonder proofreading kan deze fouten
nakijken. Het werkt steeds vertrekkend van 3’ naar 5’ toe. Dit enzym werkt
enkel als er Magnesium aanwezig is.
Proofreading = capaciteit van de polymerase gaan controleren. De
polymerase die dit niet hebben zullen af en toe foutjes ingebouwd hebben.
ii. DNA-template
Deze gebruiken als bron van het stukje DNA dat we willen gaan amplificeren.
iii. Twee primers of oligonucleotides: forward en reverse
Het is een korte oligonucleotide complementair aan target regio. Het zal
binden aan de 3’ kant, dus de open kant van de complementaire primer is 3’.
iv. Vier verschillende dNTPs.
Zijn nodig om het stukje DNA aan te maken.
v. Co-enzym: Mg2+ in buffer
DNA-polymerase heeft deze nodig voor zijn activiteit maar de concentratie
mag niet te hoog zijn want dan zal deze binden met het negatieve DNA.
Polymerase werkt enkel vanaf de 3’ kant.
B. GENTECHNOLOGIE: muteren van een gen door PCR: overlap PCR
Er worden twee aparte PCRs uitgevoerd: één aan de rechtse kant van het PCR-product
en één links. Belangrijk is dat de twee binnenste primers complementair zijn aan
elkaar, zodanig dat je in de volgende stap de twee PCR-producten aan elkaar kan
plakken en zo kan verder opbouwen. Ze bevatten een extra stukje dat niet nodig is
voor de PCR maar ervoor zal zorgen dat ze complementair zijn. Dan ga je twee PCR-
producten denatureren. Hierbij krijg je overlap met de vrije 3’ primer kanten.
Je hebt dus in totaal vier primers nodig.
i. 1 en 4: gewoon de standaard aan de twee uiteinden
ii. 2 en 3: moeten aan elkaar complementair zijn met behulp van dat extra
stukje
Figuur: Overlap PCR. Er wordt een PCR uitgevoerd met de A- en
B-primer en een aparte PCR met de C- en D-primer
2
,Figuur: Resultaat van het overlap PCR. Principe van overlap PCR
is dat je dan een tweede PCR uitvoert. Je bekomt een ligatie-PCR
waarbij je de twee PCR-producten gaat gaan mengen en dan doe
je opnieuw een PCR met enkel de primers A en D. Dit omdat de B
en C primers complementair waren, ze kunnen aan elkaar
worden geplakt. De A en D primers passen hier ook op, zo kan de
polymerase worden gebouwd. Zo wordt het eindresultaat
bekomen.
Figuur: Deletie mutatie met overlap PCR. Je wilt het oranje deel
uit het gen gooien. Primers B en C zijn complementair (te zien
aan hashtags en de cirkels die dienen voor de annealing). Primer
A en D kunnen dan mooi aan elkaar worden geplakt en zo krijg je
het oranje gedeelte kwijt.
3
, Figuur: Puntmutagenese met overlap PCR. Dit is
gemakkelijker aangezien je zeer kleine veranderingen wilt
maken in het gen. Je moet niet werken met ingewikkelde
primers. Je kan gewoon de reverse en forward primers laten
overlappen aangezien ze gedeeltelijk hetzelfde zijn. Daarna
kan je aan 5’-kant van die primer de mutatie aanbrengen die
gewenst is. Zolang het niet de dicht bij de 3’-kant is waar dat
de polymerase gaat gaan werken, vormt dit geen probleem. Je
krijgt twee PCR-amplicons met de mutatie erin en zo kan een
nieuwe PCR-reactie worden uitgevoerd.
Dat kan een heel kleine deletie zijn of een kleine insertie of de
verandering van A naar C zonder dat het interfereert met de
polymerase activiteit van het enzym.
4
