Summary

Samenvatting Gentechnologie I deel I 2de bach (BCBT, )

15 views 0 purchase

Course
Gentechnologie I

Institution
Universiteit Gent (UGent)

samenvatting van 1e deel van de cursus (voor goedkopere prijs stuur via messenger)

[Show more]

Preview 10 out of 37 pages

View example

Uploaded on April 3, 2024
Number of pages 37
Written in 2023/2024
Type Summary

restrictie enzymen
mrna analyse
pcr reactie
kloneringen
ligatie reacties
elektroforese
agarosegels

Institution
Universiteit Gent (UGent)
Education
Biochemie En Biotechnologie
Course
Gentechnologie I

jarnewinderickx

Member since 1 year 11 documents sold

$3.75

Add to cart

Add to wishlist

100% satisfaction guarantee
Immediately available after payment
Both online and in PDF
No strings attached

SAMENVATTING
GENTECHNOLOGIE:
DEEL 1
[Ondertitel van document]

Abstract
[Trek de aandacht van uw lezer met een interessante samenvatting. Dit is
meestal een kort overzicht van het document.
Wanneer u uw inhoud wilt toevoegen, klikt u hier en begint u te typen.]

Jarne Winderickx
[E-mailadres]

,1. Introductie............................................................................4
1.1 Gentechnologie + definities.........................................................4
1.2 Historiek....................................................................................4
1.3 Kloneringsproces........................................................................4
1.3.1 bereiding van het te kloneren DNA.....................................................................4
1.3.2 Invoering van geschikte vector...........................................................................4
1.3.3 Inbrengen in de GH voor amplificatie..................................................................4
1.3.4 Analyse van de transformanten..........................................................................4
1.3.5 Binnenbrengen in de gewenste GH voor verdere toepassingen..........................5

2. DNA modificerende enzymen..................................................6
2.1 Restrictie enzymen.....................................................................6
2.1.1 Algemeen............................................................................................................ 6
2.1.2 Oorsprong en voorkomen....................................................................................6
2.1.3 Verschillende types.............................................................................................6
2.1.3.1 Type I............................................................................................................ 6
2.1.3.2 Type II........................................................................................................... 6
2.1.3.3 Type III.......................................................................................................... 6
2.1.4 Naamgeving........................................................................................................ 7
2.1.5 Herkenning sequenties.......................................................................................7
2.1.6 Knipwijze............................................................................................................. 7
2.1.7 Additionele begrippen.........................................................................................7
2.1.8 Methylatie en restrictie-enzym verknipping........................................................8
2.1.9 Reactievoorwaarden...........................................................................................8
2.2 Andere nucleasen.......................................................................8
2.3 Ligasen......................................................................................9
2.4 Kinase........................................................................................9
2.5 Fosfatase...................................................................................9
2.6 Polymerasen..............................................................................9
2.7 Topoïsomerasen........................................................................10
2.8 Recombinasen..........................................................................10
3. extractie en opzuiveren van DNA..........................................11
3.1 EtOH / isopropanol precipitatie uit oplossing..............................11
3.2 Densiteitsgradiënt opzuivering..................................................12
3.3 Affiniteitszuivering....................................................................12
3.3.1 Anionuitwisselingskolom...................................................................................12
3.3.2 Silica kolom....................................................................................................... 12
3.4 Plasmide bereiding uit bacteriën...............................................12
3.4.1 Methode van Birnboim: plasmide isolatie..........................................................13
3.4.2 Plasmide-isolatie met affiniteitsopzuivering......................................................13
3.5 Bepaling van DNA/RNA opbrengst en zuiverheid.........................13
3.5.1 Spectrofotometrische detectie..........................................................................13
3.5.2 Fluorometrische detectie..................................................................................14

4. Scheiding en detectie van DNA/RNA......................................15

1

, 4.1 Principe van gelelektroforese....................................................15
4.2 Types gels................................................................................15
4.2.1 Agarose............................................................................................................. 15
4.2.2 Polyacrylamide.................................................................................................. 15
4.3 Detectiemethoden....................................................................15
4.3.1 Gelkleuringen.................................................................................................... 15
4.3.2 Southern blot detectie......................................................................................16
4.3.2.1 Denaturatie................................................................................................ 16
4.3.2.2 Blotting / transfer.......................................................................................16
4.3.2.3 Fixeren........................................................................................................ 16
4.3.2.4 Hybridisatie................................................................................................ 16
4.3.2.5 Toepassing.................................................................................................. 17
4.4 Denaturerende gel....................................................................17
4.5 Pulsed-field elektroforese (PFGE)..............................................17
4.6 Toepassingen van analytische gelscheidingen............................17
4.6.1 RFLP / restriction fragment length polymorphism.............................................17
4.6.2 SSCP / single strand conformation polymorphism.............................................18
4.7 Preparatieve gelscheiding en elutietechnieken...........................18
4.8 Capillaire elektroforese en lab on a chip.....................................18
5. PCR (polymerase chain reactie)............................................20
5.1 PCR reactie...............................................................................20
5.1.1 Overzicht........................................................................................................... 20
5.2 Optimalisatie............................................................................20
5.2.1 Primers / startsequenties..................................................................................20
5.2.2 Keuze van polymerase......................................................................................21
5.2.3 Magnesium....................................................................................................... 22
5.2.4 Buffer................................................................................................................ 22
5.3 Analyse van PCR producten.......................................................22
5.3.1 Trouble shooting................................................................................................ 22
5.4 Toepassingen + afgeleide technieken gebasseerd op PCR...........23
5.4.1 Kloneren mbv PCR............................................................................................. 23
5.4.2 Diagnostica....................................................................................................... 24
5.4.3 RAPD / rapid amplified polymorphic DNA analyse.............................................24
5.4.4 AFLP / amplified fragment lengt polymorphism PCR.........................................24
5.4.5 Real-time PCR of kwantitatieve PCR (qPCR)......................................................25
5.4.5.1 Situering..................................................................................................... 25
5.4.5.2 Overzicht.................................................................................................... 25
5.4.5.3 Detectiemethoden: SYBR Green.................................................................25
5.4.5.4 Detectiemethoden: seq. specifieke fluorescente primers en probes...........26
5.4.5.5 PCR reactie................................................................................................. 27
5.4.5.6 Data-analyse.............................................................................................. 27

6. mRNA analyse.....................................................................28
6.1 Isolatie mRNA...........................................................................28
6.2 Methodes voor het analyseren van mRNA...................................29
6.2.1 Nothern blot analyse......................................................................................... 29
6.2.2 Dot blot............................................................................................................. 29

2

, 6.2.3 Reverse transcriptie PCR / RT-PCR.....................................................................30
6.2.3.1 Werkwijze................................................................................................... 30
6.2.3.2 Kwantitatieve / real time RT-PCR.................................................................30
6.2.4 RACE (rapid amplification of cDNA ends)..........................................................31
6.2.4.1 3’RACE........................................................................................................ 31
6.2.4.2 5’RACE........................................................................................................ 31
6.2.4.3 Toepassingen RACE.....................................................................................31
6.2.5 In situ PCR......................................................................................................... 31
6.2.7 Macro-microarray.............................................................................................. 32

7. Aanmaak synthetisch DNA....................................................33
7.1 Inleiding...................................................................................33
7.2 Methodes.................................................................................33
7.2.1 Aanpak.............................................................................................................. 33

8. Mutagenese........................................................................34
8.1 Plaatsspecifieke mutagenese.....................................................34
8.1.1 Adhv unieke knipplaatsen.................................................................................34
8.1.2 Adhv primers..................................................................................................... 34
8.1.3 Synthetische genen: ipv natuurlijke genen.......................................................34
8.1.4 Zink-vinger technologie: zie hfd 2.....................................................................34
8.2 Willekeurige mutagenese..........................................................35
8.2.1 Mutatorstam..................................................................................................... 35
8.2.2 Straling............................................................................................................. 35
8.2.2.1 EM straling.................................................................................................. 35
8.2.2.2 Ioniserende straling....................................................................................35
8.2.3 Chemische mutagenese....................................................................................35
8.2.4 PCR................................................................................................................... 35
8.2.4.1 Error prone PCR.......................................................................................... 35
8.2.4.2 DNA schuffling............................................................................................ 36

3

,1. INTRODUCTIE

1.1 GENTECHNOLOGIE + DEFINITIES
 ++ methodes voor gen isoleren + amplificeren: zoals kloneren =
invoeren van bepaald DNA segment in een geschikte dragermolc. / vector
die kan amplificeert worden in levende organismen (vaak bacteriën)
o Resultaat = recombinant DNA = combinatie van 2 DNA molc van
verschillende oorsprong
o Technieken hiervoor = gentechnologie / recombinant DNA
technologie

1.2 HISTORIEK
 1944: MacLeod, MacCarty en Avery  DNA is drager van info
 1953: Watson en Crick  structuur DNA
 1955: Sanger met begin van gentechnologie  1e eiwit gesequeneerd:
insuline (redelijk klein)
 1966: genetische code: AZ – triplet door Nirenberg, Khorana en Holley
 1968: 1e stap naar genklonering  ontdekking restrictie enzymen
 1973: knippen + plakken van DNA met restrictie-enzymen door Cohen en
Boyer
o = begin van GENtechnologie
 1983: PCR techniek door Mullis = DNA fragmenten multipliceren

1.3 KLONERINGSPROCES

1.3.1 BEREIDING VAN HET TE KLONEREN DNA
 Te kloneren DNA = nieuw aangemaakt DNA (synthetisch, cDNA /
copyDNA, PCR fragmenten) of in vivo geïsoleerd DNA
 Verschil tssn 1 DNA-fragment of mengsel van ++ fragmenten
 Mutagenese = inbouwen van mutaties

1.3.2 INVOERING VAN GESCHIKTE VECTOR
 Ligatie-reactie tssn ingevoerd DNA (met gen van interesse) + vector
(meestal plasmide) mbv klassieke klonering (adhv restrictie-enzymen en
ligasen)
 Vectoren = faag vs plasmide (zie Geert Berx)

1.3.3 INBRENGEN IN DE GH VOOR AMPLIFICATIE
 Mengsel van DNA binnenbrengen in GH  te amplificeren  selectie voort
laten groeien  kolonies met zelfde recombinant NDA

1.3.4 ANALYSE VAN DE TRANSFORMANTEN
 Nagaan welke kolonies drager zijn van gewenste recombinant DNA
 Via Southern blotting, PCR, sequentiebepaling, …
 Bij bacteriële expressievectoren ook nagaan door analyse van mRNA

4

,1.3.5 BINNENBRENGEN IN DE GEWENSTE GH VOOR VERDERE TOEPASSINGEN
 Kolonies met recombinant DNA  verder groeien om voldoende
hoeveelheid te bereiden  transformatie (prokaryoten) of transfectie
(eukaryoten) naar optimale GH voor heterologe expressie
 Transformeren = binnenbrengen van vreemd DNA in bacteriën, …
transfectie = bij eukaryoten
o Transformanten = degene die positief dragen + transfectanten
= bij eukaryoten

5

,2. DNA MODIFICERENDE ENZYMEN

2.1 RESTRICTIE ENZYMEN

2.1.1 ALGEMEEN
 Restrictie-enzymen = DNasen (DNA afbreken) die DNA verknippen op
specifieke wijze  herkennen bepaalde sequenties (4-8 bp)  op gerichte
wijze dsDNA knippen  vrij 5’PO4 en 3’OH
 Behoren tot familie van endonucleasen (= nucleïnezuren intern knippen)

2.1.2 OORSPRONG EN VOORKOMEN
 Restrictie-modificatie systeem tegen bacteriofagen (= virussen tegen
bacteriën): restrictie-enzym en methylase enzym (methyl groep plaatsen
direct na replicatie)
o Grote rol van plaats-specifieke methylatie: indien geen methylgroep
op herkenningsseq.  restrictie enzym knippen  enkel vreemd
DNA knippen

2.1.3 VERSCHILLENDE TYPES

2.1.3.1 TYPE I
 Herkennen bepaalde seq maar knippen (beide strengen) op willekeurige
afstand daarvan (tot 1000 bp verder)
 3 subeenheden: specificerend eenheid, methylase en restrictie-enzym 
DNA knippen of methyleren
 Functie: vreemd DNA (moet dsDNA zijn + herkenningsseq. dragen, anders
geen herkenning) afbreken
o Herkenningsplaats herkent  enzymen gaan DNA verplaatsen (ATP
afhankelijk)  knippen buiten herkenningsplaats
 Hoe eigen DNA niet herkennen??  staat van hemi-methylatie door
semi-conservatieve replicatie  enkel methylase op in werken
 Niet nuttig!!

2.1.3.2 TYPE II
 1 subeenheid: restrictie-enzym-eenheid + methylase komt als afz. entiteit
voor
 Knippen net buiten of binnen herkenningsplaats
 Nuttig voor DNA kloneringen
 Opbouw: 2 polypeptide subeenheden  homodimeer  herkennen
symmetrisch / palindromisch DNA (door scannen van DNA) (4-8 bp) + bij
aanwezigheid van Mg  structuur wijziging  ds breuk (elk monomeer 1
streng)
o Knippen = hydrolyse van fosfodiëster binding (/ toevoegen van
water, ppt dia 43)

2.1.3.3 TYPE III
 2 subeenheden: DNA herkenning (+ modificatie) + knippen
 Knippen op korte afstand van herkenningsplaats (20-30 bp)
 Niet nuttig!!!

6

,2.1.4 NAAMGEVING
 Letterwoord (genus en species) + romeinse cijfer (kolomfractie,…)

2.1.5 HERKENNING SEQUENTIES
 Palindroom: bv bij E.coli: 5’…GAATTC…3’
3’…CTTAAG…5’
 Soms minder strikt: sommige plaatsen gewoon purine of pyrimidine ipv
specifiek nucleotide  gedegenereerde restrictie enzymen (soms niet
volledig palindromisch)
o Bv: Hind II herkent: 5’…GTPyPuAC…3’
3’…CAPuPyTG…5’
o Verzwakte symmetrie: symmetrische sequentie elementen
onderbroken door willekeurige eenheden: bv Dde I met 5’…CTNAG…
3’
3’…GANTC…5’
o Asymmetrische plaatsen: geen palindromisch herkenning  knippen
buiten specifieke herkenningsplaatsen
 Frequentie van knippen ~ lengte van herkenningsseq. : bv kans om 6 bp
terug te vinden = ^6

2.1.6 KNIPWIJZE
 Knippen  vrij 3’OH en vrij 5’PO4
 2 verschillende knipwijzen: effen / blund en versprongen
o Effen = knippen gebeurd middendoor doorheen sym. seq 
resulteert in blund ends (voordeel: met andere blunds interageren)
o
 Bv: Rsa I met 5’…GT↓ AC…3’ 5’…GT-OH pAC…3’
3’…CA ↑TG…5’
3’…CA-p HO-TG….5’

o Versprongen = knippen symmetrisch maar niet middendoor 
resulteert in sticky ends (5’ overhang (langste stuk = 5’P) of
3’overgang) (nadeel: enkel 3’ overgangen en andere 3’
overgangen kunnen met elkaar recombineren)
o
 Bv: Dde I met 5’…C↓TNAG…3’ 5’…C-OH pTNAG…3’
3’… GANT↑C…5’ 3’…GANT-p HO-C….5’

 Verknipping ook buiten herkenningsseq (type I en II)

2.1.7 ADDITIONELE BEGRIPPEN
 Isoschizomeren = enzymen van zelfde oorsprong + herkennen zelfde seq
+ knippen op zelfde manier
 Neoschizomeren = verschillende oorsprong + zelfde seq herkennen +
andere manier knippen (voorbeeld ppt dia 50)
 Overeenstemmende uiteindjes = verschillende enzymen knippen +
sticky end is zelfde
 Blund ends zijn samenvoegbaar + herknipbaar

7

,  Sticky ends zijn samenvoegbaar + herknipbaar (enkel indien van zelfde
enzym of door enzymen met minder selectieve herkenningsseq.)

2.1.8 METHYLATIE EN RESTRICTIE-ENZYM VERKNIPPING
 dam methylatie: methylgroep op A in GATC seq  enzymen die niet
meer knippen, maar ook die enkel DAM-gemethyleerd DNA knippen
 dcm methylatie: methylgroep op C in CCAGG of in CCTGG
 Indien je toch wil knippen met enzym moet je werken met dam - of dcm-
stammen

2.1.9 REACTIEVOORWAARDEN
 Enzym-eenheden / units (U) = hoeveelheid enzym die nodig is om 1 µg
DNA volledig te knippen in 1u bij bepaalde temp en buffer (met Mg!!!) met
een gegeven eindvolume
o Volume DNA oplossing = massa DNA / conc
o Eindvolume = 10 * volume buffer = 10 * volume enzymen
o Volume enzymen = x1 U/µl * massa DNA + ….
o Volume water = eindvolume – volume DNA – volume enzym
 Star-activiteit: wanneer enzymen knippen op plekken (gelijkaardig aan
herkenningsseq.) waar niet mag knippen
o Gebeurt bij extreme omstandigheden: hoge glycerolconc, lage
ionsterkte, hoge pH, andere metaalionen ipv Mg,…
 Meervoudige enzymatische afbraken / dubbeldigest  sequentieel of
gelijktijdig
o Indien enzymen in gelijke buffer werken  gelijktijdig
o Anders: eerst behandelen met enzym met laagste zoutconc 
inactivatie (zout conc stijgen) of opzuiveren (wnr meerdere
omstandigheden verschillend zijn)  omstandigheden veranderen 
2de enzym
 Langere incubatieperiode wanneer knippen aan uiteinde van DNA

2.2 ANDERE NUCLEASEN
 DNase I: niet-sequentie-specifieke endo + exonuclease
o Zet dsDNA om tot 5’P-oligonucelotiden  wordt gebruikt voor DNA
te verwijderen uit reactiemengsels
o Bij aanwezigheid van Mn2+  blund ends
 S1 nuclease: ssDNA of ssRNA (endo + exonuclease)  omzetten tot 5’P-
mononucleotiden (enkel bij Zn2+ en pH 4.5)
o Kan gebruikt worden bij nicks / ss-breuken om blund ends te maken
 Mun bean nuclease: gelijkaardig als S1 nuclease, maar geen
verknippingen van nicked DNA + activiteit beter controleerbaar (sticky 
blund maken) + enkel 5’ eindjes knippen
o Toepassing ppt dia 70
 Bal 31: verwijdert mononucleotiden van dsDNA aan 5’ +/ 3’ uiteindes
(=exonuclease) maar ook endonuclease activiteit

8

, o Ca2+ nodig, AT rijke gebieden sneller afgebroken dan GC, ++
invloed van temp en enzymconc, exo is 20x groter dan endo  meer
sticky ends (daarna behandeling met mun bean)
 Exonuclease III: 5’P-mononucelotiden wegnemen in 3’5’ richting van
dsDNA of DNA zonder 3’ overhangende sticky ends
o Vaak in combinatie met klenow / S1  verkortende fragmenten
maken
 Ribonucelase H: endoribonuclease (intern RNA knippen) in DNA-RNA
hybriden
 Zink-vinger nucleasen: polymeer zink vinger domein + FokI
endonuclease domein (functioneert als dimeer eiwit voor ss-breuk)  2
zink vinger nucleasen voor 1 dsDNA te knippen
o Zink vinger domein: α -helix in grote groef van DNA
 CRISPR/Cas9: Cas9 = RNA gestuurde DNA endonuclease geassocieerd
met CRISPR-immuunsysteem bij bacteriën (antivirale en bacteriofagen
afweer)
o Zie boek pg 31-32

2.3 LIGASEN
 Herstellen van nicks in dsDNA + blund en sticky ends samenbrengen
(enkel indien compatibel)
 Ligatie van de okazaki fragmenten van de lagging streng
 DNA + RNA ligasen: katalyseren vorming van fosfodiëster binding mbv ATP
hydrolyse (ATP  AMP + PPi)
o Sommige gebruiken NAD als cofactor  vrijstelling van AMP en NMN
(nicotinamide mononucleotide)
o 3 stappen: 1) enzym (epsilon-amine groep van lysine) + ATP 
enzym-AMP + PPi 2) enzym-AMP + 5’P  enzym + geactiveerd
5’uiteinde 3) 3’OH valt P=O aan  vrijstelling van AMP
 Na ligatie kan je niet opnieuw knippen met restrictie-enzymen
 T4 DNA ligase: katalyse van fosfodiëster binding tssn dsDNA fragmenten
o Ook Mg2+ nodig + andere stabiliserende additieven
 T4 RNA ligase: katalyse van fosfodiëster tssn 2 ssRNA of ssDNA te
vormen

2.4 KINASE
 T4 polynucleotidekinase: γ -fosfaat van ATP op vrij 5’OH zetten van
dsDNA, ssDNA, RNA en mononucleotiden
o Vlot bij 5’overhangende sticky ends, ++ slecht bij overhangende 3’
sticky ends

2.5 FOSFATASE
 BAF + CIP: verwijderen van eindstandige P-groepen (zowel 3’ als 5’)
 Gebruik van CIP = cippen  na cippen moet je zuiveren / CIP inactivatie 
verwarmen +/ EDTA

2.6 POLYMERASEN
 Soorten polymerase:
o Template = DNA  DNA pol (nieuwe keten = DNA) + RNA pol (RNA
keten)

9

The benefits of buying summaries with Stuvia:

Guaranteed quality through customer reviews

Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.

Quick and easy check-out

You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.

Focus on what matters

Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!

Frequently asked questions

What do I get when I buy this document?

You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.

Satisfaction guarantee: how does it work?

Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.

Who am I buying these notes from?

Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller jarnewinderickx. Stuvia facilitates payment to the seller.

Will I be stuck with a subscription?

No, you only buy these notes for $3.75. You're not tied to anything after your purchase.

Can Stuvia be trusted?

4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)

53340 documents were sold in the last 30 days

Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now

Start selling

Popular Universities in the United States

Popular books

Find notes and summaries for these qualifications

Seller