Samenvatting Methoden in biomedisch onderzoek 2 2e bach BMW - 93 pagina's
51 views 2 purchases
Course
Methoden in het biomedisch onderzoek 2
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Deze samenvatting is 93 pagina's lang.
Dit document bevat alle info van de slides én notities van de les.
Het is een gestructureerde samenvatting met duidelijke uitleg van alle begrippen en processen.
Van de 1e keer geslaagd!
Hoofdstuk 3: RNA
Verschil DNA en RNA:
- RNA heeft uracyl en DNA heeft thymine
- DNA is evolutionair het oudste er bestond DNA dat uracyl bevatte en dat is dan
naar thymine verandert, wat het stabieler maakt tegen mutaties
- DNA heeft deoxyribonucleic acid en RNA heeft ribonucleic ribose (hydroxygroep op 2’
zorgt voor minder stabiliteit)
- Dideoxynucleic acid: Sangersequentie
- DNA is vaak dubbelstrengig en RNA is vaak enkelstrengig + kan 3D structuur hebben
Soorten RNA:
- Paradigma: DNA RNA eiwitten
- rRNA: 95% van alle RNA is rRNA
- tRNA: translatie van RNA naar eiwitten
- mRNA: 1-4% boodschapper RNA, vertaal van DNA naar eiwitten
- Korte, niet-coderende RNA: rol bij ziekte en helpen transcriptie te reguleren,
genexpressie reguleren
- Lange, niet coderende RNA
- Small interfering RNA: cellen moduleren
Structuur mRNA:
- Pre-mRNA: intronen eruit geknipt tot matuur mRNA
- Coderende regio
- 5’ en 3’ UTR: untranslated region niet omgezet naar eiwitten
- 5’ cap en 3’ poly A staart
1. RNA voorzorgen en bewaren
Mogelijke problemen:
- RNA profiel verandert na staalafname, bv. inductie genen
- RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAasen
- DNA contaminatie: scheiding DNA /RNA is meestal onvolledig
Staalname:
- Keuze anticoagulans: best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA reacties
- RNA stabilisatie: RNA degradatie en/of inductie voorkomen
- Onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibare stikstof (-196°C)
- Totaal bloed: vacuümtube met RNA bewaarmiddel, bv. PAXgene tube
- Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel, bv. RNAlater (Ammoniumsulfaat
oplossing precipiteert eiwitten, verwijderen voor
extractie) of Trizol (al 1e stap van extractie)
1
,Staalverwerking: RNAse-vrij werken
- Zeer zuiver werken
- Labojas en handschoenen om stalen te beschermen
- Afgebakende labo-bench zone voor RNA werk
- Oppervlakten, pipetten, …: RNAse schoonmaakproduct, bv. RNAseZAP
- RNAse vrije filter-pipettips en plastics
- Nuclease-vrije oplossingen/water:
- Gefilterd water (Milli Q), RT-PCR grade water (getest op RNAsen)
- Behandeling met RNAse inhibitoren
- DEPC: reageert met amines in AZ in de katalytische site van RNAsen
en inhibeert die
- Nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
Bewaring:
- RNAse-vrij water (of TE-buffer 10/1, maar EDTA inhibeert RNAse niet, itt. DNAsen)
- Bewaring tot 1 jaar op -80°C (minder lang dan DNA)
- Langere bewaring eventueel als alcoholprecipitaat
- Beter: meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie
bewaren
DNA contaminatie:
- Niet altijd probleem, bv. niet wanneer toepassing onderscheid maakt tussen
DNA/RNA
- Detecteren: RT min controle, elektroforese
- Verwijderen: DNAse behandeling
- Toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
- DNAsel (knipt dsDNA en ssDNA) of dsDNA-specifieke DNAsen
- Inactivatie (hitte) of verwijdering DNAse na behandeling
- Nadeel: verlies of degradatie van RNA mogelijk
2. RNA extraheren
Methode:
- Afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen)
- Afhankelijk van doel (hoeveelheid, kwaliteit)
Stappen:
- Lyseren: weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud
van gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk
- Isoleren: RNA uit lysaat halen of opzuiveren (zonder eiwitten, eventueel zonder DNA)
- Oplossen: RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij
concentreren
2
,Afbraak, lysis en homogenisatie van weefsels/cellen:
- Stap in extractie van DNA, RNA en eiwitten er bestaan verschillende methoden
- Vaak toevoeging van remmers van niet-gewenste moleculen, bv. DNAsen, RNAsen,
proteasen
- Detergenten, bv. SDS, Trizol, guanidium chloride (meest gebruikt)
- Vriezen en ontdooien (lyseert, cryopreservatie om cellen intact te houden)
- Mechanische homogenisatie: pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met
pestel, bead-gebaseerde homogenisator + schudden
aan hoge snelheid
- Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator of Douncer (oplossing tussen
glazen pestels) voordeel: mild, laat celfracties
(organellen) intact
- Sonicatie (geluidsgolven): gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie, nadeel is dat
het ook DNA/RNA kan fragmenteren
2.1. RNA extractie met organische solventen (Trizol)
Trizol: acid (pH = 4,5) guanidium thiocyanaat – fenol – chloroform
Guanidium thiocyanaar: cellysis + RNAse inhibitor
Toevoegen, goed mengen, RNA (in waterlaag) nu gescheiden van DNA en eiwitten (in
organische laag + interfase = tussen 2 lagen)
Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid
Waterlaag (met RNA) overbrengen naar nieuwe tube
Gevolgd door alcoholprecipitatie van RNA uit waterlaag of kolomchromatografie
Vergelijk met DNA extractie:
- Phenol – chloroform pH 7 voor DNA extractie en Trizol pH 4,5 voor RNA extractie
- Verschil in pH en lading DNA/RNA zorgt voor scheiding RNA in waterlaag en DNA in
waterlaag of organische laag/interfase
- Combinatie-methode: verder werken met beide lagen (voor DNA en RNA extractie)
2.2. Alcoholprecipitatie
Alcoholprecipitatie uit supernatans idem zoals voor DNA alcoholprecipitatie
Principe: DNA + RNA precipiteert in aanwezigheid van zout (bv. Na) + alcohol, DNA en RNA
lost terug op in water/buffer
Zouten: Natriumacetaat (andere voor specifieke toepassingen)
Alcoholen: ethanol of isopropanol
3
, 2.3. Kolomchromatografie
Principe:
- Silica kolom idem als bij DNA extractie
- Bepaalde condities van zout + pH: selectieve binding van RNA (DNA meestal niet
100% verwijderd)
- Andere condities zetten RNA terug vrij (elutie)
Vloeistof gaat door kolom op basis van: centrifugeren, zwaartekracht of vacuüm
Verschillende types kolom commercieel beschikbaar, bv. Qiagen:
- Voordeel: eenvoudig, zeer goede zuiverheid
- Nadeel: duurder, opbrengst beperkt door capaciteit van de kolommetjes
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magneet beads uit oplossing
halen
Silica kolom:
- Buffer met chaotrope zouten (bv. guanidium chloride) lysis, nuclease inhibitie,
chaotroop zout zorgt voor selectieve binding van RNA aan silica kolom
- Spin kolom: vloeistof door kolom sturen door centrifugeren
- Elutie (losmaken): water/buffer zet RNA terug vrij
- Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magneet uit oplossing
halen bedoeling: grote schaal, high-throughput, automatisering
met robots Bv. Covid-19 diagnostische testen
3. RNA kwantificeren
Waarom:
- Inschatting opbrengst (extractie goed gelukt?), welke hoeveelheid is beschikbaar
voor experimenten
- Verschillende toepassingen vragen bepaalde concentratie/hoeveelheid RNA als input
- Afwijkende concentraties/hoeveelheden kunnen hinderen te laag: onvoldoende
input voor experiment, vooral voor weinig abundantie targets te hoog: mogelijk
inhibitie of saturatie (bv. ddPCR), meer is niet altijd beter
- Kwantificatiemethoden vergelijkbaar met DNA, maar met een aantal verschillen
Spectrofotometrie (UV/zichtbaar licht):
- Principe: absorptie van licht door RNA in oplossing
- Voordeel: snel, eenvoudig, concentratie + zuiverheid (eiwit, organische solventen)
- Nadeel: aspecifiek (absorptie door alle aanwezige moleculen), overschat
concentratie, geen onderscheid DNA-RNA (DNA contaminatie van RNA)
- Toepassing: ng/µl range
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller sarahvcr. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $13.89. You're not tied to anything after your purchase.
