Leerdoelen Labtools 2018 Life Sciences, Hoge School Utrecht
Leerdoelen les 1 ‘basisbegrippen voor scheidingsmethode en gelfiltratie’
• De basiscomponenten noemen en beschrijven van een chromatografisch systeem.
Een chromatografisch systeem bestaat uit 2 fases (die niet mengbaar zijn):
- stationaire fase (vast of vlb.) op het chromatografisch bed bijvoorbeeld: een glazen kolom.
- mobiele fase (vlb. of gas) wordt via ‘delivery system’ opgebracht.
Stoffen met een hoge affiniteit voor de stationaire fase komen vertraagd van de kolom.
• Het basisprincipe van chromatografie uitleggen.
Chromatografie = een scheidingstechniek waarmee een mengsel van stoffen gescheiden kan worden
in individuele componenten.
Preparatief -> bv insuline wordt nog gebruikt, moet nog werkzaam zijn. Gescheiden stoffen worden
nog gebruikt.
Analytisch -> alleen weten wat erin zit, stoffen mogen vernietigd worden.
• De verschillende vormen van chromatografische systemen noemen, beschrijven en schematisch
tekenen.
- Dunne laag chromatografie (Thin Layer Chromatografy):
Adsorptie chromatografie ->TLC (thin layer chrom) nog steeds veel gebruikt in lab. Snel en
goedkoop. Als je geen referentiestoffen hebt, kan je de Rf (loopafstand) bepalen. Deze eigenschap is
afhankelijk van de stof en op te zoeken in bijvoorbeeld BINAS.
Stationaire fase-> dunne laag absorberend materiaal zoals bijvoorbeeld silica gel.
Mobiele fase -> beweegt over de stationaire fase door capillaire werking.
Detectie -> aankleuren / UV /radioactief.
- Kolom chromatografie:
De stationaire fase (bv een gel) en mobiele fase bevinden zich in een kolom. De stationaire fase
wordt constant aangevuld en de scheidingen worden in fracties opgevangen. Hierbij kan ook een
detector worden gebruikt voor het opvangen van de verschillende fracties. Het nadeel van KC is dat
er diffusie ontstaat, dit veroorzaakt een minder goede scheiding. Door de druk te verhogen verhoogt
de elutie-snelheid, dit zorgt voor een betere scheiding.
- HPLC high performance liquid chromatografy:
HPLC is een componenten systeem wat bestand is tegen hoge druk. Dit systeem wordt vooral
gebruikt voor kleine biologische moleculen.
,Het is belangrijk dat er geen viezigheid in de HPLC komt of luchtbellen. Daarom wordt het
loopvloeistof altijd eerst ontgast. Wanneer het sample wordt geladen, wordt er gedetecteerd
hoelang het sample erover doet om over de kolom te gaan. Er worden verschillende kolommen
gebruikt voor verschillende scheidingen.
- Eluens (= loopvloeistof): gradiënt mogelijk of isocratisch
- Kolom is afhankelijk van type scheiding
- Detectors: UV/VIS, fluorescentie, elektrochemisch.
Isocratisch = de vloeistof bestaat uit dezelfde samenstelling.
- FPLC Fast Protein Liquid Chromatography:
De FPLC wordt vooral gebruikt voor grote biologische moleculen. Het systeem geeft een lage druk
zodat er geen eiwit denaturatie kan veroorzaken. Bij hoge druk zullen eiwitten namelijk uit elkaar
vallen.
- GC Gas chromatografie:
Bij gas chromatografie is de mobiele fase een gas. Relatief weinig gebruikt in de Life-sciences.
Loopvloeistof -> gas
Vaste fase -> vloeistof
- Partitie chromatografie:
Vindt plaats in een vloeistof-gebonden fasekolom, de stationaire fase is altijd een vloeistof die niet
oplosbaar is in de mobiele fase. De mobiele fase kan wel of niet vloeibaar zijn.
- Adsorptie chromatografie:
Stationaire fase is altijd vloeibaar. De Rf en Rx waardes bereken bij een dunne laag chromatogram:
• De Rf en Rx waardes bereken bij een dunne laag chromatogram.
Rf = afgelegde afstand stof / afgelegde afstand oplosmiddel
Rx = afgelegde afstand stof / afgelegde afstand referentie
Rx en RF waardes zijn in tabelen op te zoeken
• Een chromatogram interpreteren en de selectiviteit en resolutie berekenen aan de hand van dit
chromatogram.
,Dode tijd = eerste piek wat in de grafiek voorkomt. De dode tijd is de tijd/volume die nodig is voor de
mobiele fase om de kolom te verlaten.
Retentietijd = pieken die na de dode tijd afkomen. De retentie tijd is de tijd tussen injecteren van het
monster en het midden van de piek van het eluaat.
Oppervlakte onder de piek = mate hoeveelheid stof (lengte x breedte piek)
Netto retentie berekening = retentietijd – dode tijd = netto tijd.
Selectiviteit is de mate van chromatografische scheiding
𝑡𝑏 −𝑡0
Selectiviteit → 𝛼 = 𝑡𝑎 −𝑡0
Elke piek staat in een optimale situatie voor 1 stof. Hoe groter het oppervlak, hoe meer stof.
2(𝑡𝑎 −𝑡𝑏 )
Resolutie → R = 𝑊𝑎 + 𝑊𝑏
Het verschil in retentietijden tussen twee stoffen gedeeld door de piekbreedtes aan de basis.
Efficientie → Schotelgetal
Verhogen van de efficiëntie:
- Lengte kolom langer maken (kan wel meer diffusie ontstaan)
- Kwaliteit materiaal (kost wel meer geld)
- Constante doorloopsnelheid
Het schotelgetal is een maat voor de hoeveelheid pieken (schotels) die je goed gescheiden van elkaar
van een kolom kunt krijgen
Externe standaardisatie
Piek oppervlakte (of hoogte) van concentratiereeks van standaard in losse runs. → Ijklijn
Interne standaardisatie
Toevoegen van referentie-stof aan sample (die er niet van nature in zit). Bepaal de respons-factor
met standaarden. Met de verhouding tussen referentie-stof en je stof die je wilt meten bepaal je de
concentratie.
,• Een onderverdeling maken in chromatografische technieken naar uitvoeringsvorm, gebruikte
stationaire en mobiele fasen en scheidingsprincipe.
• Praktisch toepasbare voorstellen doen om de resolutie tussen twee stoffen te verbeteren (ook
voor scheidingstechnieken uit latere lessen).
De resolutie is pas hoog genoeg wanneer de retentietijden van 2 stoffen te onderscheiden zijn. De
resolutie kan verbeterd worden door:
- de retentie- / capaciteitsfactor te verhogen, de interactie tussen de gescheiden stof en de
stationaire fase.
- de scheidings- / selectiviteitsfactor verhogen, de scheiding tussen 2 stoffen bij een bepaalde
instelling.
- het schotelgetal verhogen, de efficiëntie van de scheiding .
- optimale temperatuur.
- hoeveelheid stof.
• De verschillende vormen van detectoren bij vloeistof chromatografie beschrijven.
Spectrofotometrie: Meet de absorptie van licht bij een specifieke golflengte
- Fluorescentiedetector: meet fluorescentie (emissie van licht door aangeslagen moleculen)
- Brekingsindexdetector
- Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
- Massaspectrometrie
,• Berekenen wat de concentratie van een stof is aan de hand van een chromatogram waarin een
interne standaard is meegelopen.
– Interne standaardisatie: Toevoegen van referentie-stof aan sample (die er niet van nature in zit).
Bepaal de respons-factor met standaarden. Met de verhouding tussen referentie-stof en je stof die je
wilt meten bepaal je de concentratie.
Het verschil = (piek 1- piek 2)/piek 1 x 100% = uitkomst – 100 % = verschil tussen de twee pieken.
Externe standaardisatie: de piek oppervlakte (of hoogte) van de concentratiereeks van de standaard
in losse runs. De externe standaardisatie wordt bepaald m.b.v. de ijklijn.
• Het principe van de gelfiltratie uitleggen.
Gelfiltratie wordt gebruikt om eiwitten van verschillende grootte van elkaar te scheiden. Het principe
van gelfiltratie berust erop dat kleine eiwitten een langere weg door een poreuze matrix moeten
afleggen dan de grote eiwitten. Het gevolg is dat kleine eiwitten later van de kolom elueren (van de
kolom afkomen) dan grote eiwitten. Eiwitten van verschillende grootte hebben dus een verschillende
hoeveelheid eluens (oplosmiddel / buffer) nodig om van de kolom te elueren. De verschillende
eluties worden aan het einde van de kolom in aparte buizen verzameld, zodat eiwitten van
verschillende grootte van elkaar worden gescheiden. De verschillende buizen worden vervolgens
geanalyseerd op de aanwezigheid van eiwitten en verder bewerkt.
• Voorspellingen doen met betrekking tot de scheiding van aminozuren, eiwitten en/of
eiwitcomplexen op basis van gelfiltratie.
Kleine eiwitten komen later van de kolom elueren (van de kolom afkomen) dan grote eiwitten.
• De molmassa berekenen van een onbekend eiwit als het elutievolume bekend is en er voldoende
marker eiwitten zijn met een bekende molmassa en elutievolume.
Bij een gelfiltratie experiment wordt een Sephadex G75 kolom gebruikt (fractioneringsbereik 5 kDa-
100 kDa). Er worden twee markermoleculen in het lineaire bereik van de kolom gebruikt. Eiwit A
(70kDa) heeft een elutievolume van 45mL, eiwit B (40kDa) heeft een elutievolume van 80mL.
Bereken de molmassa van een eiwit dat een elutievolume heeft van 60mL op deze kolom. De
molmassa van dit eiwit ligt:
y = ax+b
y-as = molmassa
x-as = elutievolume
a = verschil y / verschil x
a = (log(70) – log(40)) / (45-80) = -6,9x10-3
b = y-ax
b = log(70) – (-6,9x10-3 * 45 ml) = 2,16
Y = ax+b
y = (-6,9x10-3 * 60) + 2,16 = 1,74
Logmolmassa = 1,74
Molmassa = 101,74 = 55 kDa
De molmassa met een elutievolume van 60 ml is 55 kDa
, Leerdoelen les 2 ‘affiniteitschromatografie en scheiding op basis van polariteit’
• De basisstructuur van een α-aminozuur tekenen en beschrijven.
Een aminozuur bestaat altijd uit een:
- aminogroep
- carboxylgroep
- restgroep
- koolstof
• De primaire, secundaire, tertiaire en quaternaire structuur van een eiwit beschrijven.
Primair = de primaire structuur van een eiwit bestaat uit en keten van aminozuren.
Secundair = de secundaire structuur van een eiwit bestaat uit: waterstofbruggen die verbindingen
vormen tussen de aminozuren -> alfahelix en betasheets worden gevormd.
Tertiair = de tertiaire structuur van een eiwit bestaat uit meerdere bindingen zoals:
- waterstoffen bruggen
- hydrofobe acties
- vd Waals interacties
- ion bindingen
- disulfide bruggen
- zwavelbruggen, is een covalente binding (sterktes binding)
Er zijn nu ook verbindingen gemaakt tussen de alfahelix en de betasheets. De alfahelixen bestaan nu
uit kringels, en de betasheets uit lange platen.
Quaternair = iedere alfahelix en betasheet is een eigen eiwit. Het eiwit betstaat dus uit verschillende
subeenheden.
Leerdoelen les 1 ‘basisbegrippen voor scheidingsmethode en gelfiltratie’
• De basiscomponenten noemen en beschrijven van een chromatografisch systeem.
Een chromatografisch systeem bestaat uit 2 fases (die niet mengbaar zijn):
- stationaire fase (vast of vlb.) op het chromatografisch bed bijvoorbeeld: een glazen kolom.
- mobiele fase (vlb. of gas) wordt via ‘delivery system’ opgebracht.
Stoffen met een hoge affiniteit voor de stationaire fase komen vertraagd van de kolom.
• Het basisprincipe van chromatografie uitleggen.
Chromatografie = een scheidingstechniek waarmee een mengsel van stoffen gescheiden kan worden
in individuele componenten.
Preparatief -> bv insuline wordt nog gebruikt, moet nog werkzaam zijn. Gescheiden stoffen worden
nog gebruikt.
Analytisch -> alleen weten wat erin zit, stoffen mogen vernietigd worden.
• De verschillende vormen van chromatografische systemen noemen, beschrijven en schematisch
tekenen.
- Dunne laag chromatografie (Thin Layer Chromatografy):
Adsorptie chromatografie ->TLC (thin layer chrom) nog steeds veel gebruikt in lab. Snel en
goedkoop. Als je geen referentiestoffen hebt, kan je de Rf (loopafstand) bepalen. Deze eigenschap is
afhankelijk van de stof en op te zoeken in bijvoorbeeld BINAS.
Stationaire fase-> dunne laag absorberend materiaal zoals bijvoorbeeld silica gel.
Mobiele fase -> beweegt over de stationaire fase door capillaire werking.
Detectie -> aankleuren / UV /radioactief.
- Kolom chromatografie:
De stationaire fase (bv een gel) en mobiele fase bevinden zich in een kolom. De stationaire fase
wordt constant aangevuld en de scheidingen worden in fracties opgevangen. Hierbij kan ook een
detector worden gebruikt voor het opvangen van de verschillende fracties. Het nadeel van KC is dat
er diffusie ontstaat, dit veroorzaakt een minder goede scheiding. Door de druk te verhogen verhoogt
de elutie-snelheid, dit zorgt voor een betere scheiding.
- HPLC high performance liquid chromatografy:
HPLC is een componenten systeem wat bestand is tegen hoge druk. Dit systeem wordt vooral
gebruikt voor kleine biologische moleculen.
,Het is belangrijk dat er geen viezigheid in de HPLC komt of luchtbellen. Daarom wordt het
loopvloeistof altijd eerst ontgast. Wanneer het sample wordt geladen, wordt er gedetecteerd
hoelang het sample erover doet om over de kolom te gaan. Er worden verschillende kolommen
gebruikt voor verschillende scheidingen.
- Eluens (= loopvloeistof): gradiënt mogelijk of isocratisch
- Kolom is afhankelijk van type scheiding
- Detectors: UV/VIS, fluorescentie, elektrochemisch.
Isocratisch = de vloeistof bestaat uit dezelfde samenstelling.
- FPLC Fast Protein Liquid Chromatography:
De FPLC wordt vooral gebruikt voor grote biologische moleculen. Het systeem geeft een lage druk
zodat er geen eiwit denaturatie kan veroorzaken. Bij hoge druk zullen eiwitten namelijk uit elkaar
vallen.
- GC Gas chromatografie:
Bij gas chromatografie is de mobiele fase een gas. Relatief weinig gebruikt in de Life-sciences.
Loopvloeistof -> gas
Vaste fase -> vloeistof
- Partitie chromatografie:
Vindt plaats in een vloeistof-gebonden fasekolom, de stationaire fase is altijd een vloeistof die niet
oplosbaar is in de mobiele fase. De mobiele fase kan wel of niet vloeibaar zijn.
- Adsorptie chromatografie:
Stationaire fase is altijd vloeibaar. De Rf en Rx waardes bereken bij een dunne laag chromatogram:
• De Rf en Rx waardes bereken bij een dunne laag chromatogram.
Rf = afgelegde afstand stof / afgelegde afstand oplosmiddel
Rx = afgelegde afstand stof / afgelegde afstand referentie
Rx en RF waardes zijn in tabelen op te zoeken
• Een chromatogram interpreteren en de selectiviteit en resolutie berekenen aan de hand van dit
chromatogram.
,Dode tijd = eerste piek wat in de grafiek voorkomt. De dode tijd is de tijd/volume die nodig is voor de
mobiele fase om de kolom te verlaten.
Retentietijd = pieken die na de dode tijd afkomen. De retentie tijd is de tijd tussen injecteren van het
monster en het midden van de piek van het eluaat.
Oppervlakte onder de piek = mate hoeveelheid stof (lengte x breedte piek)
Netto retentie berekening = retentietijd – dode tijd = netto tijd.
Selectiviteit is de mate van chromatografische scheiding
𝑡𝑏 −𝑡0
Selectiviteit → 𝛼 = 𝑡𝑎 −𝑡0
Elke piek staat in een optimale situatie voor 1 stof. Hoe groter het oppervlak, hoe meer stof.
2(𝑡𝑎 −𝑡𝑏 )
Resolutie → R = 𝑊𝑎 + 𝑊𝑏
Het verschil in retentietijden tussen twee stoffen gedeeld door de piekbreedtes aan de basis.
Efficientie → Schotelgetal
Verhogen van de efficiëntie:
- Lengte kolom langer maken (kan wel meer diffusie ontstaan)
- Kwaliteit materiaal (kost wel meer geld)
- Constante doorloopsnelheid
Het schotelgetal is een maat voor de hoeveelheid pieken (schotels) die je goed gescheiden van elkaar
van een kolom kunt krijgen
Externe standaardisatie
Piek oppervlakte (of hoogte) van concentratiereeks van standaard in losse runs. → Ijklijn
Interne standaardisatie
Toevoegen van referentie-stof aan sample (die er niet van nature in zit). Bepaal de respons-factor
met standaarden. Met de verhouding tussen referentie-stof en je stof die je wilt meten bepaal je de
concentratie.
,• Een onderverdeling maken in chromatografische technieken naar uitvoeringsvorm, gebruikte
stationaire en mobiele fasen en scheidingsprincipe.
• Praktisch toepasbare voorstellen doen om de resolutie tussen twee stoffen te verbeteren (ook
voor scheidingstechnieken uit latere lessen).
De resolutie is pas hoog genoeg wanneer de retentietijden van 2 stoffen te onderscheiden zijn. De
resolutie kan verbeterd worden door:
- de retentie- / capaciteitsfactor te verhogen, de interactie tussen de gescheiden stof en de
stationaire fase.
- de scheidings- / selectiviteitsfactor verhogen, de scheiding tussen 2 stoffen bij een bepaalde
instelling.
- het schotelgetal verhogen, de efficiëntie van de scheiding .
- optimale temperatuur.
- hoeveelheid stof.
• De verschillende vormen van detectoren bij vloeistof chromatografie beschrijven.
Spectrofotometrie: Meet de absorptie van licht bij een specifieke golflengte
- Fluorescentiedetector: meet fluorescentie (emissie van licht door aangeslagen moleculen)
- Brekingsindexdetector
- Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
- Massaspectrometrie
,• Berekenen wat de concentratie van een stof is aan de hand van een chromatogram waarin een
interne standaard is meegelopen.
– Interne standaardisatie: Toevoegen van referentie-stof aan sample (die er niet van nature in zit).
Bepaal de respons-factor met standaarden. Met de verhouding tussen referentie-stof en je stof die je
wilt meten bepaal je de concentratie.
Het verschil = (piek 1- piek 2)/piek 1 x 100% = uitkomst – 100 % = verschil tussen de twee pieken.
Externe standaardisatie: de piek oppervlakte (of hoogte) van de concentratiereeks van de standaard
in losse runs. De externe standaardisatie wordt bepaald m.b.v. de ijklijn.
• Het principe van de gelfiltratie uitleggen.
Gelfiltratie wordt gebruikt om eiwitten van verschillende grootte van elkaar te scheiden. Het principe
van gelfiltratie berust erop dat kleine eiwitten een langere weg door een poreuze matrix moeten
afleggen dan de grote eiwitten. Het gevolg is dat kleine eiwitten later van de kolom elueren (van de
kolom afkomen) dan grote eiwitten. Eiwitten van verschillende grootte hebben dus een verschillende
hoeveelheid eluens (oplosmiddel / buffer) nodig om van de kolom te elueren. De verschillende
eluties worden aan het einde van de kolom in aparte buizen verzameld, zodat eiwitten van
verschillende grootte van elkaar worden gescheiden. De verschillende buizen worden vervolgens
geanalyseerd op de aanwezigheid van eiwitten en verder bewerkt.
• Voorspellingen doen met betrekking tot de scheiding van aminozuren, eiwitten en/of
eiwitcomplexen op basis van gelfiltratie.
Kleine eiwitten komen later van de kolom elueren (van de kolom afkomen) dan grote eiwitten.
• De molmassa berekenen van een onbekend eiwit als het elutievolume bekend is en er voldoende
marker eiwitten zijn met een bekende molmassa en elutievolume.
Bij een gelfiltratie experiment wordt een Sephadex G75 kolom gebruikt (fractioneringsbereik 5 kDa-
100 kDa). Er worden twee markermoleculen in het lineaire bereik van de kolom gebruikt. Eiwit A
(70kDa) heeft een elutievolume van 45mL, eiwit B (40kDa) heeft een elutievolume van 80mL.
Bereken de molmassa van een eiwit dat een elutievolume heeft van 60mL op deze kolom. De
molmassa van dit eiwit ligt:
y = ax+b
y-as = molmassa
x-as = elutievolume
a = verschil y / verschil x
a = (log(70) – log(40)) / (45-80) = -6,9x10-3
b = y-ax
b = log(70) – (-6,9x10-3 * 45 ml) = 2,16
Y = ax+b
y = (-6,9x10-3 * 60) + 2,16 = 1,74
Logmolmassa = 1,74
Molmassa = 101,74 = 55 kDa
De molmassa met een elutievolume van 60 ml is 55 kDa
, Leerdoelen les 2 ‘affiniteitschromatografie en scheiding op basis van polariteit’
• De basisstructuur van een α-aminozuur tekenen en beschrijven.
Een aminozuur bestaat altijd uit een:
- aminogroep
- carboxylgroep
- restgroep
- koolstof
• De primaire, secundaire, tertiaire en quaternaire structuur van een eiwit beschrijven.
Primair = de primaire structuur van een eiwit bestaat uit en keten van aminozuren.
Secundair = de secundaire structuur van een eiwit bestaat uit: waterstofbruggen die verbindingen
vormen tussen de aminozuren -> alfahelix en betasheets worden gevormd.
Tertiair = de tertiaire structuur van een eiwit bestaat uit meerdere bindingen zoals:
- waterstoffen bruggen
- hydrofobe acties
- vd Waals interacties
- ion bindingen
- disulfide bruggen
- zwavelbruggen, is een covalente binding (sterktes binding)
Er zijn nu ook verbindingen gemaakt tussen de alfahelix en de betasheets. De alfahelixen bestaan nu
uit kringels, en de betasheets uit lange platen.
Quaternair = iedere alfahelix en betasheet is een eigen eiwit. Het eiwit betstaat dus uit verschillende
subeenheden.
