Summary
Samenvatting Moleculaire technieken Course 5 blok 1
- Course
- Institution
Samenvatting van alle moleculaire technieken lessen in Course 5 blok 1.
[Show more]
Seller
Follow
noramfaro
Content preview
Moleculaire technieken course 5 blok 1Week 1
PCR en primer design
PCR is een techniek die gebruikt wordt voor het amplificeren van DNA.
In blok 1 wordt PCR gebruikt voor het kloneren van een gen. Humane kankercellen bevatten
het IDH1 gen. Het mRNA wordt uit de kankercel gehaald en door middel van reverse
transcriptase wordt er cDNA gemaakt. cDNA bevat hierdoor alleen maar exonen. Om te
bepalen of de mutatie effect heeft op de enzymactiviteit moet het enzym geïsoleerd worden.
Doordat de humane kankercel maar heel weinig van het eiwit bevat is het lastig te
onderzoeken. Daarom wordt het humane gen in het bacteriële DNA geplakt. De bacterie
deelt zich heel snel waardoor er veel van het IDH1 gen aanwezig is. De plasmide wordt in
een andere bacterie geplakt, die door inductie voor eiwit expressie zorgt. Een voorbeeld van
gebruik van klonering is het maken van humaan insuline.
Het doel van PCR: het amplificeren van DNA en het toevoegen van restrictie sites.
- Denaturatie: het dubbelstrengs template DNA wordt enkelstrengs.
- Annealing: de primers binden aan het enkelstrengs DNA, waardoor er een vrij 3’-OH
einde is voor DNA polymerase.
- Elongatie: dNTP’s worden gebonden aan de nieuwe streng.
Primer design
Er wordt bij PCR een forward en reverse
primer gebruikt. De forward primer bindt aan
de 3’-5’ streng. Door rechts onderaan de
complementaire streng te binden ontstaat er
een vrij 3’-OH einde waardoor DNA
polymerase een complementair stuk kan
maken onder de strand.
,Bij de reverse primer werkt het hetzelfde maar dan andersom. Let bij het schrijven van de
primers op dat beiden geschreven moeten worden van 5’-3’.
Oefenopdrachten in de powerpoint.
Vereisten voor een goede primer design
- Forward en reverse primer wijzen met de 3’ einden naar elkaar toe.
- Primers zijn 18 tot 24 nucleotiden lang.
- GC content is ongeveer 50-60%.
- Het 3’ einde moet een G of C bevatten.
- Er zijn geen complementaire sequenties binnen de primer (hairpin).
- De primers zijn niet complementair aan elkaar (primer dimers).
- Het verschil in annealing temperatuur is maximaal 5 graden.
Primers komen niet buiten de coderende sequentie.
Annealing temperaturen
Te hoog: Primers kunnen niet binden. Hierdoor is er geen product.
Te laag: Primers hebben aspecifieke binding. Dit zorgt voor incorrecte producten en primer
dimers.
Te ver uit elkaar: Maar één van de twee primers kan binden. Hierdoor ontstaat er
enkelstrengs DNA.
Vermijd bij het ontwerpen van een primer stukken sequentie met veel AT/GC. Hierdoor zal
de primer niet specifiek bij één basenpaar binden.
Bepalen van de elongatie tijd
Taq DNA polymerase heeft een snelheid van 1 kB/min.
Gradiënt PCR: techniek waarbij de optimale annealing temperatuur
voor een primerset wordt bepaald. Elke cyclus heeft een andere,
oplopende temperatuur. Op de gel zal duidelijk zijn welke temperatuur
optimaal is voor de primers.
Touchdown PCR: techniek waarbij aspecifieke binding
geminimaliseerd wordt. De annealingstemperatuur wordt bij elke
cyclus lager. Uit de gel zal duidelijk worden welke temperatuur de
meest specifieke producten geeft. Dit product bestaat alleen uit de
target sequentie, en bevat geen primer dimers.
Kolonie PCR: techniek waarbij een bacteriële kolonie wordt
toegevoegd als DNA template. Hierdoor kan bepaald
worden of de kolonie een plasmide bevat. Bij de
denaturatie stap lyseren de cellen en komt het DNA vrij. In
de praktijk wordt kolonie PCR gebruikt om te bepalen of de
E. coli TOP10 en BL21(DE3) cellen het recombinant DNA
bevatten. Voor dit type PCR is geen proofreading nodig.
, Week 2
Clonerings vector: klein DNA molecuul. Van een virus, plasmide of ander organisme, dat
stabiel onderhouden kan worden in een ander organisme en waar een vreemd DNA
fragment in gezet kan worden.
Standaard onderdelen van een vector:
- antibiotica resistentie gen. Bijvoorbeeld AMP/BLA: een resistentie gen tegen
ampicilline of beta-lactam. Door het resistentie gen blijft de plasmide in de host cel.
De plasmide is essentieel voor de overleving van de cel, als de cel zich in een
medium met antibiotica bevindt.
- ORI: origin of replication. Het startpunt voor de replicatie van de plasmide. Circulair
DNA heeft maar één ORI.
- MCS/Polylinker: de plek waar het insert in de plasmide wordt gezet. De MCS bevat
verschillende restrictie sites. Dit zijn de plekken waar restrictie enzymen kunnen
knippen. Verschillende restrictie sites zijn van belang omdat het insert DNA van
zichzelf ook een restrictie site in de sequentie heeft zitten. De enzymen zouden dan
in het insert DNA knippen. Doordat er verschillende restrictie sites zijn, kunnen
verschillende enzymen gekozen worden.
Restrictie enzymen: dimeer enzym. Knipt het DNA op twee plekken
door waardoor het een dubbelstrengsbreuk is.
Blunt ends: Het dubbelstrengs DNA wordt recht doorgeknipt. Er
steekt niets uit.
Sticky ends: Het restrictie enzym knipt het DNA op verschillende
plekken in de restrictie site. Hierdoor ontstaat er een overhang. Deze
overhang is essentieel bij klonering omdat het insert op die manier in
de vector kan knippen.
5’ overhang: 5’ kant is langer.
3’ overhang: 3’ kant is langer.
De restrictie enzymen knippen zowel de plasmide als de insert. Hierbij ontstaat er een gat in
de plasmide waar het insert precies in past.
Hoe maak je een PCR product dat in een MCS kan worden gekloneerd?
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller noramfaro. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $6.95. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
53068 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now