Samenvatting - Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (U03D7A)
12 views 0 purchase
Course
Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (U03D7A)
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Alle notities van de lessen en de slides zijn opgenomen in deze samenvatting, zelf een 16/20 gehaald. Alles staat erin, ook andere vrienden die de samenvatting gebruikt hebben zijn er altijd door geweest!
1. DNA -> dubbelstrengig, RNA -> enkelstrengig
2. RNA is korter
3. DNA -> thymine, RNA -> uracil
4. DNA -> 3’OH uiteinde, RNA -> 2’OH uiteinde (zeer vatbaar voor RNasen)
Dideoxyribosen (ddNTPs) -> Sanger sequentie -> stoppen van ketenverlenging
Soorten RNA
mRNA, tRNA en rRNA; paradigma coderend RNA
(replicatie) DNA (transcriptie) -> RNA (translatie) -> proteïne
coderend en niet-coderend RNA
mRNA = coderend
tRNA en rRNA = niet-coderend
- mRNA = 1-4% van het totale RNA gewicht
- rRNA = 80-95% van het totale RNA gewicht
- short ncRNAs = <200 nucleotiden lang
- IncRNA = >200 nucleotiden lang
RNA voorzorgen en bewaren
Voorzorgen bij staalname, werken met en bewaren van RNA
Problemen:
- RNA profiel -> veranderd na staalname (bv. inductie genen)
- RNA degradatie -> RNasen (endogeen en exogeen zijn)
1
, - DNA contaminatie -> scheiding van DNA/RNA = onvolledig
Staalname:
1. Anticoagulans kiezen: best EDTA -> heparine inhibeert DNA en RNA reacties
2. Stabiliseren van RNA: RNA degradatie/inductie voorkomen
onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibaar stikstof (-196°)
bloed RNA: vacuümtube met RNA bewaarmiddel (bv. PAXgene tube)
cellen/weefsels RNA: RNA bewaarmiddel (bv. RNAlater = ammoniumsulfaat oplossing
die eiwitten precipiteert -> verwijderen voor extractie, of Trizol = eerste stap van extractie)
DNA zal onveranderd blijven tijdens staalname = stabieler. DNA is gemakkelijk vrij van RNA
te maken door RNasen toe te voegen.
Staalverwerking
RNasen vrij werken!
- Zuiver werken
- Labojas en handschoenen -> bescherming stalen
- Labo/bench-zone voor RNA werk
- Oppervlakte en pipetten -> RNasen schoonmaakproduct (bv. RNasen ZAP)
- Filter pipettips
- Nuclease-vrije oplossingen en water
o Gefilterd water (milli-Q), RT-PCR grade water (getest op RNasen)
o Behandeling met RNasen inhibitoren
▪ DEPC (carcinogeen!) = reageert met amines in az (vnl. histidine) in de
katalytische site van RNasen en inhibeert deze. (Tris = amine; DEPC
werkt niet in Trisbuffer)
▪ Nieuwere RNasen inhibitoren zijn minder carcinogeen
Bewaring
- RNasen vrij water of TE-buffer 10/1, maar EDTA inhibeert RNasen niet: enkel DNasen
- Bewaring tot 1 jaar op -80° (< dan bewering DNA)
- Als alcoholprecipitaat > bewaring
- Meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie beweren =
BETER
DNA contaminatie
- Niet altijd een probleem; als er onderscheid gemaakt wordt tussen DNA en RNA bij
een proef
- DETECTEREN;
o RT-min controle
o Elektroforese
- VERWIJDEREN; DNasen behandeling
o Toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
o DNAsel ( knipt dsDNA en ssDNA) of dsDNA-specifieke DNasen
o NADEEL: verlies/degradatie van RNA is mogelijk
Methode = afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriën en virussen)
en afhankelijk van het doel (hoeveel nodig, kwaliteit, …)
Essentiële stappen
1. Lyseren; weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud van
gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk
2. Isoleren; RNA uit het lysaat halen en opzuiveren
3. Concentreren; RNA in het gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen en
concentreren
Afbraak, lysis en homogenisatie van weefsels/cellen
- Verschillende methoden afh. van weefsel en celtype, volume en aantal stalen,
moleculen en toepassing.
- Remmers toegevoegd van niet-gewenste moleculen (DNasen en RNasen en
proteasen)
- Detergenten (bv. SDS, Trizol, guanidium chloride) = meest gebruikt
- Vriezen en ontdooien; lyseert i.t.t. cryopreservatie om cellen intact/leefbaar te
houden
- Mechanische homogenisatie; pletten in vloeibare stikstof (mortier en Pestel), bead-
gebaseerde homogenisator en schudden aan een hoge snelheid.
- Vloeibare homogenisator; Douncer = oplossing tussen glazen pestels
VOORDEEL = mild, laat celorganellen intact
- Sonicatie; gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie
NADEEL = kan ook DNA/RNA fragmenteren
RNA extractie met organische solventen -> TRIZOL
Trizol = zuur PH 4-5 (guanidium thiocyanaat, fenol en chloroform)
- Guanidium thiocyanaat: cel lysis + RNase inhibitor
- VOORDEEL= goedkoop, eenvoudig, goede opbrengst en zuiverheid
Toevoegen -> goed mengen -> RNA is gescheiden van DNA en eiwitten -> waterlaag met RNA
overbrengen in een nieuwe tube -> gevolgd door alcoholprecipitatie of kolomchromatografie
Vergelijking met DNA extractie
DNA: phenol – chloroform PH7 voor DNA extractie
RNA: Trizol PH 4-5 voor RNA extractie
Verschil in PH en lading zorgt voor scheiding van DNA en RNA
RNA in de waterlaag
DNA in de waterlaag of organische laag/interfase
3
, 1. Alcoholprecipitatie
Uit supernatans
principe: DNA en RNA (PO3- groep) -> precipiteert in de aanwezigheid van zout + alcohol,
DNA + RNA lost terug op in water/buffer
Zouten: natriumacetaat
Alcoholen: ethanol of isopropanol
Bij lage concentraties en bij lage temperaturen! OF een drager toevoegen (glycogeen)
DNA fosfaatgroep is – geladen (hydrofiel), wanneer – lading geneutraliseerd wordt
door een + lading wordt dit hydrofoob.
Eiwitten slaan al neer met zout in een waterige oplossing voor DNA moet alcohol
toegevoegd worden.
2. Kolomchromatografie
Principe:
selectieve binding van RNA -> bepaalde condities van zout + pH (andere condities zetten
RNA terug vrij = elutie)
Vloeistof gaat door de silica kolom o.b.v.:
- Centrifuge
- Zwaartekracht
- Vacuüm
Verschillende type kolommen:
- VOORDEEL = eenvoudig en zeer goede zuiverheid
- NADEEL = duurder, opbrengst beperkt door capaciteit van de kolommetjes
Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magnetische beads uit
oplossing halen ; bedoeling = grote schaal, high-throughput en automatisering met
robots
vb. Covid-19 diagnostische testen
Silica kolom
- Buffer met chaotrope zouten (guanidium chloride)
o Lysis
o Nuclease inhibitie
o Chaotroop zout zorgt voor selectieve binding van RNA aan silica kolom
- Spin kolom = vloeistof door kolom sturen -> centrifugatie
- Elutie = losmaken -> water/buffer zet RNA terug vrij
RNA kwantificeren
Waarom? Inschatting opbrengst (welke hoeveelheid beschikbaar voor het experiment),
verschillende experimenten vragen een bepaalde concentratie/hoeveelheid RNA als input.
afwijkende concentraties/hoeveelheden kunnen HINDEREN:
- Te laag; weinig abundante targets indien er onvoldoende input is voor het
experiment.
- Te hoog; inhibitie of saturatie mogelijk, meer is niet altijd beter
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller emmameynaerts. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $14.51. You're not tied to anything after your purchase.
