Wilson and Walker\\\'s Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology
Samenvatting moleculaire biologische technieken. MBT. Wilson and Walker, Principles and Techniques of biochemistry and molecular biology, 8th edition. Campbell and Farrel, Biochemistry, 8th edition. Alberts et al, Molecular biology of the cell, 6th edition,
Waarom PCR? Aanwezigheid van een gen of andere sequentie aantonen
- TEK (kolonie PCR op UVRC gen)
- MBE (kolonie PCR op H2B gen)
- Identificatie van mo
- Identificatie van personen en forensisch onderzoek
Forensische PCR
Een piek in het DNA profiel (DNA sequentie) homozygoot
2 pieken in het DNA profiel (DNA sequentie) heterozygoot
Proces PCR en analyse
- PCR
- Agarose gel electrophoresis
- UV visualisation
- The final product
Promotor, gen of andere genetische onderdelen kloneren
DNA polymerase beweegt over het DNA van 3’ 5’
DNA polymerase maakt het DNA van 5’ 3’
Doel van PCR specifiek stuk DNA in vitro te kopiëren (amplificeren)
Proces DNA replicatie
,Waarmee maak je een PCR reactie specifiek? In de DNA replicatie maakt Primase
RNA primers
Verschillen replicatie vs PCR
Replicatie PCR
Helicase Denaturatie (hoge temperatuur 96
graden)
RNA primers Artificiële DNA primers (Oligo’s)
37 graden 72 graden met Taq Polymerase
(bacterie waar het enzym in zit groeit
in gijzers, overleeft hele hoge
temperaturen (werkt het beste bij 72
graden)
PCR reactiemengsel;
- DNA (template)
- Twee primers (forward en reverse)
- Nucleotiden
- Tag polymerase
- Buffer
PCR wat heb je nodig?
- Forward en reverse startpunt DNA polymerase
- Nucleotiden bouwstenen DNA
- KCl monovalent cation (K+) voor optimale binding primers
- Tris buffer voor optimale pH voor enzym
- MgCl2 divalent cation als cofactor voor enzym
- DNA polymerase Enzym dat DNA repliceert
- 102 -105 kopiën DNA template DNA dat geamplificeerd wordt
PCR stappen; 1 PCR cyclus (30-40 keer herhalen)
- Denaturatie (uitsmelten) 90-96 graden dsDNA wordt ssDNA, 15 s – 30 s
- Annealing (hybridisatie primer) 50-65 graden primers binden op ssDNA,
15 s – 30 s
, - Extensie (elongatie door polymerase) 72 graden DNA wordt verdubbeld ,
30 s – 5 min (hoe groter het stuk is dat gekopiërd moet worden, hoe meer
tijd je nodig hebt)
- DNA synthese , 72 graden , 10 min
- 30-40 x herhalen
Na een cycli heb je 2n keer zoveel materiaal (30cycli ; 109 keer zoveel)
Primers ontwerpen
Annealen van primers
- Primers (oligo’s ) korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nt)
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G, A, T, C
- Elke sequentie te maken
- Specifiek
Stel een primer is gatg (4nt lang)
Om de hoeveel nt kan deze dan specifiek binden?
Dan moeten de 1e, 2e en de 3e en de 4e base passen
De kans hierop is ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (1/4)4 = 1/256
Dus de primer bindt statistisch 1 om de 256 basen
Een DNA fragment van 1000 bp heeft dan ongeveer 4 bindingsplaatsen voor deze
primer (1000/256=4)
Stel een primer is 20 nt lang. Om de hoeveel nt kan deze dan specifiek binden?
De kans hierop is (1/4) 20 – 1/( 1 1012) basen
Dus een primer van 20 nt lang komt in 1 per 1*10 12 basen voor
Humane genoom ; 3*109
Willekeurige primer van 20 nt kan statistisch minder dan 1 keer in het humane
genoom binden
Forward primer, dezelfde sequentie als begin
Reverse primer, reverse complementair
Algemene regels voor primer design
-3’ – end G of C (binding is sterker, 3 waterstofbruggen)
-17-28 bp
-40- 60 % GC
-voorkom primer dimeren (anders bindt forward en reverse primer aan elkaar, ipv
aan template DNA)
-voorkom interne ‘self-annealing) anders hairpin
-Tm tussen 50 en 70 graden wanneer 50 % van de primer nog bindt aan target
sequentie
Wordt gemeten door fluorescerend molecuul dat bindt aan enkelstrengs ( of
DS??.. ) DNA
Smelttemperatuur (Tm) = Wanneer 50 % ssDNA en 50% dsDNA is
Smelttemperatuur berekenen;
Tm = 2(A+T) + 4(C+G)
Annealingstemperatuur (Ta) = Tm – 5 graden
Laagste Ta = temperatuur die je in de PCR reactie gebruikt
, Wat kan er gebeuren als er een lagere temperatuur wordt gebruikt bij annealing
primer wordt aspecifiek, bindt op verkeerde sequentie (Base), kunnen andere
PCR producten ontstaan
Taq DNA polymerase Thermus aquaticus (optimum synthese temperatuur 72
graden)
-Hitte stabiel
-Geen proofreading activiteit
-1 kb/min
Proofreading wanneer er een foute base wordt ingebouwd tijdens polymerase,
wordt er dmv hun 3’ 5’ exonuclease activiteit zelf verwijderd dmv polymerases.
Niet alle polymerases hebben proofreading activiteit (bv Taq)
Bronnen template DNA (RNA) (monster)
-klinisch, forensisch, aarde, platen ,fossielen
Template DNA; voorwaarden voor in PCR reacties
-meestal wordt DNA gezuiverd (je weet dan zuiverheid en hoeveelheid)
-Geen remmers van DNA polymerase ( bijvoorbeeld heem groep in hemoglobine,
humuszuur in aarde)
-target bereikbaar voor primers en Taq
-Geen EDTA (of hele lage concentratie; Mg2+
-niet teveel fragmentatie/afbraak
-niet te vaak vriezen/ontdooien
Factoren die degradatie van DNA bevorderen
- Tijd
- Temperatuur
- Vochtigheid
- Licht (UV)
- Blootstelling aan chemicaliën
MBT-hoorcollege Kloneren
Hoe kloneer je een PCR-product? Primers ontwikkelen, primers bevatten extra
sequentie wat niet bindt aan stuk DNA van interesse.
De 5 stappen van het kloneren
- Restrictie-enzymen knippen
- Ligase plakt
- Vectoren
Waarom kloneren? Manipuleren van DNA om eiwit in grote hoeveelheden te
produceren, functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken, effect
van gen mutanten bestuderen.
Promotor kloneren luciferase uit fruitvliegje
5 stappen kloneren:
- Digestie: DNA (plasmide of een PCR-product) met RE knippen
- Ligatie: DNA fragment in het plasmide inbouwen recombinant
- Transformatie: de plasmiden worden opgenomen door de bacteriën
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller aliciadekr. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.16. You're not tied to anything after your purchase.
