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PCR biología celular
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Trata sobre los principios de la pcr en biología molecular
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stefaniaoliveroslondoo
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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDASFACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
GENÉTICA MOLECULAR
STEFANIA OLIVEROS LONDOÑO 20162140457
PAULA CAMILA PAIPILLA 20162140459
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PCR
La técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) revolucionó la biología molecular
pues cumple con los requisitos de especificidad que exige la caracterización de los ácido.
Los nucleicos que conforman el ADN. Actualmente se sabe que la misión de la PCR es
ampliar y copiar millones de veces una secuencia específica del ADN blanco mediante una
catálisis llevada a cabo por la enzima ADN polimerasa. La PCR es tan importante que se
aplica en diferentes campos de las ciencias biológicas y médicas, en muchos laboratorios
científicos se utiliza esta técnica principalmente para la expresión génica, genotipificación,
detección de patógenos (bacterias, virus, hongos) y análisis de mutaciones.
Durante los últimos años se han empleado diversos métodos para el diagnóstico rápido y
fiable de los agentes causales de las enfermedades infecciosas, entre todos estos métodos
el más confiable y certero es la PCR que se aplica satisfactoriamente en la microbiología
clínica.
Sin embargo, en cada laboratorio los protocolos varían en función del tipo de muestra
clínica de partida como también puede variar la temperatura, tiempo y número de ciclos, así
que los parámetros cambian según el fabricante , pero de forma general todos cumplen con
un procedimiento que consta de tres pasos en cada ciclo: Desnaturalización, alineamiento y
extensión.
Para entender claramente lo que se describe más adelante se explicará brevemente en qué
consiste cada paso ; en la desnaturalización se separan o se desnaturalizan las dos
cadenas complementarias del ADN blanco , lo cual se logra con un aumento de la
temperatura aproximadamente de 95°C durante 20-30 segundos, en el alineamiento los
primers se alinean al extremo 3´ previamente separado e hibridan con su secuencia
complementaria teniendo en cuenta que la temperatura Tm debe ser óptima , entre los
, 50-60°C, por último en la extensión la ADN polimerasa extiende la longitud de los
fragmentos iniciadores que se encuentran unidos al ADN blanco , dando origen a nuevas
cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas del ADN desnaturalizado al inicio,
este proceso de tres pasos es repetido aproximadamente 30 veces duplicándose cada vez
más el número de moléculas del producto , esta amplificación exponencial tiene como
resultado un gran número de copias de la secuencia de ADN.
A continuación, se mencionara la importancia de la PCR en la medicina y microbiología
clínica, pues su valor diagnóstico es alto porque la detección de bacterias y virus es posible
si se utilizan los segmentos iniciadores correctos, también la PCR constituye un método
eficaz en el diagnóstico precoz de determinados tipos de cáncer porque mediante esta
técnica se puede determinar la mutación del gen controlador del crecimiento celular.
Por lo tanto, microorganismos como E. coli, el VIH, el VHB entre otros han sido estudiados
con diferentes técnicas de PCR, pues estos organismos han generado graves afectaciones
en la salud pública causando miles de muertes anuales a nivel mundial en todas las edades.
E. coli constituye el microorganismo más abundante de la microbiota gastrointestinal
humana desempeñando una función importante en el funcionamiento adecuado del sistema
digestivo. Sin embargo, distintas cepas de E. coli son agentes causales de varias
enfermedades presentando una alta capacidad de dispersión vía cadena alimenticia o
mediante transmisión hídrica, lo cual ha generado brotes de diarrea, colitis hemorrágica y
síndrome hemolítico urémico. De relevancia clínica existen las cepas portadoras de la
información genética necesaria para la producción de toxinas Shiga (cepas STEC). Al
presentar tanta relevancia en el sector médico, en el año 2001 se publicó un nuevo
protocolo de PCR múltiple que permitió la detección simultánea de los genes stx1, stx2, y
rfb O157 los cuales codifican STEC y el serotipo de superficie O157, y en el año 2005 en
Argentina se realizó la validación de este protocolo lo cual posibilitó la detección de genes
de virulencia y toxicidad asociados a E. coli permitiendo diferenciar las variedades más
patógenas.
La validación de la técnica se realizó en dos laboratorios independientes de forma paralela,
utilizando diferentes equipos y reactivos, comparando dos técnicas diferentes de extracción
de ADN, también se evaluó el desempeño de la técnica al combinar distintas
concentraciones de dos cepas STEC. En la validación de la técnica se hicieron algunas
modificaciones al compararlo en dos laboratorios, la extracción de ADN con buffer Tritón
permitió obtener las cantidades adecuadas de ADN con alta pureza lo cual amerita una
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