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Trata sobre los primers y/o cebadores en biología celular
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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDASFacultad de ciencias y educación
Licenciatura en biología
Genética molecular
Diseño de primers o cebadores para PCR
Stefania Oliveros Londoño - 20162140457; Paula Camila Paipilla Garzón - 20162140459
Un iniciador o cebador es una secuencia corta de ADN de cadena simple que se utiliza en
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el método PCR se emplea un par de
cebadores para hibridar con el ADN de la muestra y definir la región del ADN que será
amplificada. También se les conoce como oligonucleótidos.
Los primers se añaden en un vasto exceso comparado con el ADN blanco a ser amplificado.
Estos se hibridan a las cadenas opuestas del blanco y se orientan enfrentándose con sus
respectivos terminales 3’, de manera tal que la síntesis llevada a cabo por la ADN
polimerasa se extiende a través de todo el segmento del ADN blanco situado entre ellos.
Recordemos que la enzima ADN polimerasa cataliza el crecimiento de cadenas de ADN
nuevas en la dirección 5’ > 3’.
Para que la PCR sea exitosa se necesita de un buen diseño de primer o cebadores siendo
uno de los aspectos más importantes, Primers mal diseñados pueden amplificar otros
fragmentos de ADN distintos a los buscados (amplificación inespecífica).
Criterios de selección de primers
● Cada primer individual debe contar con una longitud de 18-24 bases.
● Se debe mantener un contenido de G:C (Guanina:Citosina) entre 40 y 60 %.
● Los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión “Tm” cercanos, dentro
de los 2-3 °C máximo.
● La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2
bases púricas.
● Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
● Evitar poli X.
● Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5’ del primer (no incluir
cuando se estima la Tm del primer).
● Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer: a - Se
incrementa el riesgo de amplificación inespecífica. b - Se disminuye la concentración
en la mezcla de cada uno de los primers posibles c - No se recomienda utilizar más
de 64 primers diferentes en la mezcla.
Especificidad
La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primers deben
ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será
amplificado. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a
productos no deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se
amplifica una sola clona de una biblioteca genómica.
, Secuencias Complementarias del primer
Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología entre
ellos. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de doble
cadena que interferirá con el alineamiento. Si la homología ocurre en el extremo 3' de
cualquier primer, ocurrirá la formación de dímeros de primer que, a menudo, prevendrá la
formación del producto deseado por competición.
Contenido de G/C
La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La
secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de
poliC que pueden promover el reconocimiento no específico. Las regiones poliA y poliT
deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto
puede bajar la eficacia de la amplificación. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y
~20 bases de largo. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C - 62°C.
Secuencia de los extremos 3'
Es establecido que la posición terminal 3' en primers de PCR es esencial para el control del
“mispriming”. La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3' de los primers ayuda
a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3' debido al enlace de hidrógeno más
fuerte de los residuos G/C. También ayuda a mejorar la eficacia de la reacción reduciendo al
mínimo la respiración que pudo ocurrir.
Temperatura de Asociación
La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores más determinantes de
la reacción. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociación la temperatura
de fusión -5ºC, aproximadamente. Existen muchos métodos para calcular la temperatura de
fusión, pero siempre, después de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y
ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión
para determinar la temperatura óptima para cada reacción. (Giorgio,2009)
Diseño de primer
Para el diseño de nuestro cebador utilizamos una herramienta bioinformatica llamada
Primer3plus la cual es de libre uso y fácil acceso en la web.
Este software permite especificar un gran número de variables y obtener primers
según las indicaciones solicitadas. Además permite agregar el número de acceso de la
secuencia, que se halla en las bases de datos internacionales. También permite discriminar
las
regiones de la secuencia que se deben incluir, las que se deben excluir y el rango de
tamaños
del producto. Por otra parte, el software incluye la posibilidad de especificar las
características
mínimas de los primers deseados, como Tm, porcentaje de GC, máxima
autocomplementariedad, y otros parámetros. También presenta las mismas facilidades si se
está buscando y analizando una sonda, por ejemplo, para utilizarse en trabajos de
hibridación.
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