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Apuntes de la asignatura de bioquímica completos, ciencias ambientales URJC
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Apuntes completos de la asignatura de bioquímica de ciencias ambientales URJC
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TEMA 14. INTRODUCCIÓN A LA TEORÍA DEL ADN RECOMBINANTE- Aislado de un gen de interés mediante endonucleasas de restricción.
- Clonación en un vector para introducir ese gen en un organismo hospedador.
- Inducción de la expresión del producto génico codificado por ese gen transferido.
El propósito es producir cantidades suficientes del producto génico para estudio general de su
función, aplicaciones biotecnológicas, modelización de enfermedades, etc.
ENZIMAS
Enzimas comúnmente utilizados en biotecnología:
- Nucleasas: mellan, cortan o degradan DNA.
- Ligasas: unen moléculas de DNA.
- Enzimas modificadoras: Añaden o eliminan grupos (T4PNK, CIAP, Transferasas, etc).
- Polimerasas: sintetizan DNA o RNA, o bien completan la síntesis de moléculas previas.
VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS Y BACTERIÓFAGOS
Un experimento de DNA recombinante generalmente presenta el siguiente esquema:
1.- El DNA de un organismo donador se extrae, se corta con endonucleasas de restricción y se
liga a otro DNA (vector de clonación) para formar una nueva molécula de DNA recombinado
(construcción de DNA).
2.- Esta construcción vector de clonación-DNA insertado se transfiere y mantiene dentro de
una célula hospedadora. La introducción del DNA en la célula hospedadora se denomina
transformación.
3.- Aquellas células que han tomado la construcción de DNA (células transformadas) se
identifican y seleccionan, separándolas de aquellas que no contienen la construcción.
4.- Si es necesario, la construcción de DNA puede manipularse para asegurarnos que la
proteína que es codificada por la secuencia del DNA clonado va a ser producida por la célula
hospedadora.
Plásmidos usados en tecnología del ADN recombinante
Propósito: clonación general y construcción de genotecas.
1.- Pequeño tamaño (3-5 Kb).
2.- Elementos indispensables: ori, MCS, marcadores (resistencia/metabólicos) y otros.
3.- Número de copias (control de replicación estricto/relajado).
4.- Transmisibilidad: Conjugación (operón traF) y movilidad (oriT).
5.- Compatibilidad de distintos plásmidos en la misma bacteria.
1
, Transformación con vectores de expresión
Vectores de expresión procarióticos (T7) y eucarióticos (CMV).
Se induce la expresión mediante agentes químicos (IPTG, por ejemplo), suministrados a la
bacteria a través del medio de cultivo.
Bacteriófago λ
Cósmidos: reemplazamiento total de las secuencias del bacteriófago, salvo por la presencia de
las secuencias COS.
La ausencia de lcI (inserción) o de los genes red/gam (reemplazamiento) permiten la entrada
en ciclo lítico.
CLONACIÓN IN SILICO
La clonación por simulación computacional o clonación in silico es una técnica basada en
herramientas bioinformáticas, que permite predecir la inserción de un fragmento de ADN en
un vector de clonación.
Elementos a considerar cuando se analizan secuencias nucleotídicas y aminoacídicas
depositadas en bases de datos:
1.- Calidad de la base de datos: bien estructurada, con toda la información accesible y con
entradas revisadas y actualizadas con frecuencia (actualización automática/por expertos).
2.- Algoritmo de búsqueda de información óptimo para extraer la información de la base de
datos: Herramienta Blast.
3.- Análisis estadístico para validar los resultados de la búsqueda: valor asignado al falso
positivo.
SECUENCIACIÓN Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Técnicas basadas en hibridación de ácidos nucleicos:
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