Summary
Samenvatting theorie Experimental Design & Cell Culture
- Course
- Institution
Deze samenvatting bevat het theoriedeel voor het vak Experimental Design & Cell Culture (EDCC).
[Show more]
Seller
Follow
nienkespronk
Content preview
Experimental Design & CellCulture
Life Sciences – Hogeschool Utrecht
Semester 3
Hoofdstuk 1
HeLa cellijn: de eerste humane onsterfelijke cellijn die oneindig kan delen onder ideale
kweekomstandigheden
Cel- en weefselkweek wordt breed toegepast om bijvoorbeeld de invloeden van toxische stoffen,
medicijnen, groeifactoren en andere mediatoren te onderzoeken.
Een organoid is iets ‘lijkend op een orgaan’, een simpelere versie van een orgaan gekweekt in vitro
(buiten het lichaam). Ze worden gekweekt uit stamcellen, waarna ze differentiëren in het specifieke
orgaantje.
Tissue engineering: hierbij wordt er gestreefd om deficiënt weefsel van een bepaald orgaan te
regenereren met gekweekt weefsel. Er wordt ook gebruik gemaakt van stamcellen met daarbij
stoffen en cellen die normaal ook in het orgaan voorkomen
Bijvoorbeeld: hartkleppen die defect zijn worden met tissue engineering behandeld.
Hiervoor worden dan stamcellen van de patiënt zelf gebruikt
Bij weefselkweek gaat men uit van kleine stukjes weefsel van 1-2mm 3 die rechtstreeks uit het
weefsel of orgaan verwijderd worden
Bij celkweek gaat men uit van organen of orgaandelen waaruit individuele cellen losgemaakt worden
door het weefsel in kleine stukjes te snijden
Primaire cultuur = rechtstreeks afkomstig van het orgaan van mens, dier of
embryo en bestaat over het algemeen uit meerdere celtypen die in het orgaan
voorkomen. Vaak instabiel, omdat de ene cel beter kan groeien dan de andere
onder dezelfde omstandigheden. Ze kunnen maar een aantal keer gepasseerd
worden
Continue cultuur = cellen die onbeperkt in cultuur gehouden kunnen worden.
Hierin kunnen mutaties optreden. Dit proces heet transformatie en kan leiden
,tot onder andere immortaliteit.
Het overgaan in een continue cultuur is geen vanzelfsprekend proces
Vaak kunnen continue celculturen nog steeds wel veranderen. Daarom worden ze na 30 tot 40
passages vaak in fracties ingevroren zodat er een voorraad goede cellen is.
Hoofdstuk 2
Bij het werken met cellen moet je je houden aan de VMT regels (Veilige Microbiologische
Technieken)
Tijdens onze lessen werken we op een ML-I lab.
Er wordt gewerkt in een laminaire flow kast, LAF.
Hiervan zijn er horizontale en verticale
Horizontaal:
- Meest eenvoudig, kast kan helemaal open aan de voorkant
- HEPA filter waardoor de lucht naar buiten geblazen wordt
- Kweek wordt hierbij beschermd tegen contaminaties van buitenaf
- Onderzoeker niet beschermd
Verticaal:
- Heeft 3 verschillende klassen:
o Klasse I bio-safety kast: lucht wordt uit de omgeving naar binnen gezogen
Rest van de voorkant is beschermd door een ruit
Beschermd onderzoeker wel maar proef niet
o Klasse II bio-safety kast: hiermee gaan wij ook werken
Lucht wordt via een apart HEPA aangezogen.
Onderaan aan de voor en achterkant wordt lucht afgezogen om de ruimte van de
kast te sluiten met de buitenlucht
Zowel proef als onderzoeker beschermd
o Klasse III bio-safety kast: buitenlucht permanent afgesloten door handschoenen
Hierin kan gewerkt worden met zeer besmettelijke materalen
,HEPA filter = high-efficiency particulate air filter
Haalt deeltjes uit de lucht van groter dan 0,3 micrometer
Gebruik van een LAF kast:
- Kast op tijd aanzetten
- Ontsmetten met 70% alcohol
- Kast moet niet te vol
- Roosters mogen niet geblokkeerd worden
- Niet met handen boven open plaat op fles
Cellen kunnen groeien en monolaag (op een oppervlak) of in suspensie (in oplossing)
Vaak worden cellen gekweekt in een kweekfles, wat wij ook doen. Wanneer deze volgegroeid is
(confluentie 100%) moeten de cellen gesplitst en doorgezet worden in een nieuwe fles.
passeren of doorzetten
Passage nummer is het aantal keer dat een oude passage is doorgezet.
Cellen in een nieuwe kweekfles krijgen altijd nieuw medium met verse voedingsstoffen
Wanneer cellen in suspensie groeien zijn ze moeilijk te isoleren en over te kweken.
Voor hechtende cellen kan dit makkelijker.
Om cellen los te maken wordt trypsine gebruikt; een enzym dat betrokken is bij de hechting van
eiwitten. Vaak wordt er ook EDTA gebruikt om cellen nog beter los te maken, wat calcium wegvangt
en sommige adhesiemoleculen
Met PBS (phosphate-buffered saline) was je de restjes medium van de cellen af.
Daarna kan je de cellen trypsineren waarmee ze losgemaakt worden. Dit kan bij kamertemperatuur.
Dit moet niet te lang, dus trypsine moet ook geïnactiveerd worden anders worden de cellen te veel
aangetast. Dit inactiveren kan met nieuw medium en serum.
Een deel van de cellen kan nu overgebracht worden in een nieuwe kweekfles die aangevuld wordt
met nieuw medium.
Dus het doorzetten van hechtende cellen:
1. Oud medium verwijderen
2. Cellen wassen met PBS
3. Trypsiniseren (niet te lang!)
4. Trypsine inactiveren door toevoegen nieuw medium met serum
5. Deel van de cellen overbrengen in nieuwe kweekfles
6. Aanvullen met vers medium, 37oC of kamertemperatuur
, Bij niet hechtende cellen zijn alleen de laatste 2 stappen nodig.
De extracellulaire matrix is een complex van verschillende eiwitten en andere moleculen. Dit zorgt
voor hechting aan de kweekfles, polarisatie, de vorm, het metabolisme en de differentiatie van de
cellen
Belangrijke componenten:
Proteoglycanen: Dit zijn langgerekte vezels die bestaan uit een centrale eiwitstructuur waaraan
glycosaminoglycanen covalent gebonden zijn. Glycosaminoglycanen zijn polysaccharide ketens
die op hun beurt bestaan uit repeterende disaccharides.
Collageen: Collageen is een goed georganiseerd vezelachtig eiwit dat voorkomt in alle
meercellige organismen. Het wordt vooral door cellen van het bindweefsel gemaakt
(fibroblasten bijvoorbeeld). In zoogdieren wordt bijna 25% van al het eiwit dat voorkomt in het
organisme in beslag genomen door de collageenfractie.
Elastische vezels: Weefsels zoals huid, bloedvaten en longen moeten naast sterk ook elastisch
zijn. Elastische vezels in de extracellulaire matrix van deze weefsels zorgen voor de nodige
rekbaarheid. De voornaamste component van elastische vezels is elastine.
Fibronectine: Fibronectine is een van de eiwitten die een belangrijke rol speelt bij de interactie
tussen cellen en componenten van de extracellulaire matrix. Dit glycoproteïne behoort tot de
groep van de adhesie-glycoproteïnen van de extracellulaire matrix en heeft bindingsdomeinen
voor verschillende onderdelen van de extracellulaire matrix en voor eiwitten op de celmembraan
(integrines).
Calciumionen (Ca2+) spelen een belangrijke rol in het instandhouden van de binding van cellen
aan elkaar en aan de extracellulaire matrix.
Cellen in kweek kunnen deze componenten zelf maken.
tissue culture treated = het coaten en behandelen van cellen zodat ze beter hechten.
Om cellen te tellen is het belangrijk om alleen de levende cellen te tellen. Hiervoor kan trypan blauw
gebruikt worden. Alleen dode cellen nemen dit in zich op. De verhouding dode/levende cellen geeft
een indruk van hoe zorgvuldig de proeven zijn uitgevoerd
Automatisch tellen:
Met de Coultercounter:
Dit principe berust op de eigenschap dat cellen elektrische stroom minder goed geleiden dan de
oplossing waarin ze zich bevinden. Tijdens het proces wordt een elektrische spanning aangelegd
tussen 2 elektroden met daartussen een telbuis met cel suspensie. Een verandering in signaal geeft
aan dat er een cel is gepasseerd.
De hoogte van het signaal is een maat voor het volume van de cel.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller nienkespronk. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $5.02. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
53068 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now