Summary
Samenvatting Biochemistry - Hoofdstuk 3
- Course
- Institution
- Book
Nederlandse samenvatting van Biochemistry
[Show more]
Connected book
Book Title:
Author(s):
- Edition:
- ISBN:
- Edition:
More summaries for
-
Test Bank for Lehninger Principles of Biochemistry 7th Edition by Nelson (complete, questions/answers/rationales) | Lehninger Principles of Biochemistry 7th Edition Nelson Test Bank
-
FULL TEST BANK Lehninger Principles Of Biochemistry Seventh Edition By David L. Nelson (Author) Latest Update Questions And Answers Graded A+
-
Test Bank For Lehninger Principles of Biochemistry, 7th Edition by LEHNINGER Chapter 1-28
Seller
Follow
FFV
Reviews received
Content preview
Metabolisme hoofdstuk 3Voor het bestuderen van eiwitten moeten de eiwitten eerst gescheiden worden van de andere
componenten van de cel, ook wel purificatie. De eiwitten kunnen gescheiden worden op basis van
grootte, oplosbaarheid, lading en affiniteit. Na de zuivering kan de aminozuur sequentie worden
bepaald. Vervolgens kan een deel van deze sequentie gebruikt worden om het eiwit te matchen aan
al bekende eiwitten in een database. Ook de massa van het eiwit (middels massaspectrometrie) kan
gebruikt worden om een eiwit te matchen aan een eiwit in de database.
Antilichamen worden gebruikt om eiwitten in vivo te lokaliseren.
De driedimensionale structuur van het eiwit wordt bepaald middels X-ray kristallografie en Nuclear
Magnetic Resonance (NMR).
Proteome: alle eiwitten die op een bepaald moment in de cel tot expressie komen. Het proteome is
groter dan het genoom omdat uit een bepaald gen meerdere eiwitten gevormd kunnen worden en
deze eiwitten interacties met elkaar aan kunnen gaan. Het proteome is dynamisch.
Purificatie leidt tot een monster met maar een type molecuul. Om te kijken naar het succes van de
verscheidene purificatie stappen wordt een assay gebruikt. Een positief resultaat betekent dat het
eiwit aanwezig is. Hoe specifieker het assay is des te succesvoller is de purificatie. Voor enzymen
meet het assay de enzyme activity: het vermogen van de enzymen om een reactie te doen verlopen,
dit kan bijvoorbeeld gemeten worden in de toename van licht absorptie. Daarnaast moet ook de
totale hoeveelheid eiwit in het monster worden bepaald om zo de specific activity te berekenen. De
specific activity zal toenamen als de zuivering verder verloopt.
Om te bepalen waar in de cel het gezuiverde eiwit het meeste voorkomt moet een homogenaat
gevormnd worden door het celmembraan te verbreken. Middels centrifugatie bevindt zich onderop
een pellet met zwaar materiaal en hierboven ligt het supernatant. De supernatant wordt weer
gecentrifugeert met een grotere kracht waardoor er weer een pellet en een supernatant overblijftl.
Deze defferentiele centrifugatie levert meerdere fracties. Elke fractie wordt apart van elkaar gebruikt
voor een essay voor de gewenste activiteit. De fractie met de hoogste activiteit wordt gebruikt als
materiaal voor verdere zuiveringstechnieken.
Purificatie technieken:
1. Salting out: de meeste eiwitten zijn minder oplosbaar bij een hoge zout concentratie. Bij
welke zout concentratie dit gebeurt verschilt per eiwit. Daarnaast kan salting out gebruikt
worden om een oplossing te verdikken. Dialysis kan vervolgens gebruikt worden om de
zouten weer te verwijderen.
2. Dialysis: een eiwit mengsel wordt in een dyalisis zak geplaatst. De zak, gemaakt van een
semipermeabel membraan, wordt in een buffer oplossing geplaatst. Moleculen met een
diameter groter dan de poriën blijven in de zak. Dit is bruikbaar om kleine van grote
moleculen te scheiden, maar kan niet gebruikt worden om specifieke eiwitten van elkaar te
onderscheiden.
3. Gel-filtration chromatography: een monster wordt aan de bovenzijde van een colum
gebracht. De kolom is gemaakt van kraaltjes van een onoplosbaar polymeer zoals dextran,
agarose of polyacrylamide. Kleine moleculen moleculen gaan de kralen in waardoor de grote
muleculen sneller door de kolom bewegen dan de kleine.
4. Ion-exchange chromatography: als een eiwit een positieve lading heeft bij een pH van 7 zal
deze binden aan het kolom materiaal gemaakt van kralen met carboxylaat groepen. Door de
concentratie van een zout te verhogen zullen uiteindelijk ook de positief geladen eiwitten
loslaten. De eiwitten met de laagste lading zullen zo het eerste door de kolom lopen, dit
, wordt ook wel cation exchange chromatography genoemd. Voor anion exchange
chormatography wordt een positief geladen kolom, van diethylaminoethylcellulose gebruikt.
5. Affinity chromatography: in kralen worden moleculen geplaatst waar het doelwit eiwit een
grote affiniteit voor heeft. Als het monster over de kolom heeft gelopen wordt de kolom
gespoeld met het materiaal van de kralen zodat de eiwitten loslaten van de kralen en met de
oplossing mee spoelen. Deze methode wordt veel gebruikt voor het zuiveren van
transcriptiefactoren waarbij DNA-sequenties op de kralen worden gezet. Het kan ook
gebruikt worden om eiwitten die geproduceerd zijn door klonatie te isoleren. Hiervoor wordt
er een histidine tag toegevoegd aan het gen wat gekloneerd wordt. De histidine tag bindt
aan nikkel en andere metaalionen op de kralen zodat de eiwitten gescheiden worden. Dit is
de krachtigste zuiveringsmethode.
6. High-preformance liquid chromatography: het kolom materiaal is meer gedefineerd en heeft
zo meer bindingsplaatsen en een hoger oplossingsvermogen. Er moet druk worden
toegediend om het monster over de kolom te laten lopen, hierdoor verloopt de scheiding
sneller en met een hogere resolutie. Onder aan het kolom wordt een detector geplaatst die
voor elk individueel eiwit een piek weergeeft.
Gel electrophoresis wordt gebruikt om te bepalen of het aantal eiwitten per zuiveringsstap
daadwerkelijk afneemt. Deze techniek gaat ervan uit dat een geladen molecuul zal bewegen in een
geladen veld. Hiervoor wordt de volgende berekening gebruikt: v = Ez / f
Electrophoretische scheidingen verlopen op een poreuze gel, hiervoor wordt polyacrylamide gel
gebruikt. Electroforese is anders dan gel filtratie omdat alle moleculen ongeacht de grootte door
dezelfde matrix worden getrokken door de kracht van het elektrische veld. Voor het gebruik van de
gel worden de eiwitten eerst gedenatureerd in een oplossing van sodium dodecyl sulfaat (SDS). SDS
wordt toegediend in een ratio van één SDS anion voor twee aminozuren. Door de binding van SDS
krijgt het eiwit een negatieve lading die ongeveer proportioneel is voor de massa van het eiwit. Als
de eiwitten door het kolom gelopen zijn worden ze gekleurd door bijvoorbeeld coomassie blauw. Als
er radioactieve labels zijn toegediend kunnen deze gekleurd worden middels een x-ray film over de
gel, ook wel autoradiography. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is snel, gevoelig en in staat tot
een grote mate van zuivering. Gedurende de zuiveringsstappen moeten er steeds minder banden
zichtbaar zijn na de electrophoresis en moet één band steeds duidelijker worden.
- Het voordeel van SDS is dus dat de eiwitten negatief geladen worden zodat deze door de gel
lopen.
Isoelectric focussing maakt gebruik van het scheiden van eiwitten op basis van hun relatieve
hoeveelheid zuren en basen. Het isoelectrische punt (pI) is de pH waarbij de netto lading van het
eiwit 0 is. Eiwitten die verschillen in een netto lading van 1 kunnen al van elkaar onderscheden
worden.
- De pI van een zuur eiwit is hoog, door de lage pH moet dit eiwit zich in een basische
omgeving bevinden om een netto lading van 0 te hebben.
- De pI is dus niet de pH waarbij het eiwit een lading van 0 heeft maar waarbij de netto lading
van het eiwit 0 is.
- De eiwitten met de hoge pH bevinden zich aan de cathode (-) de eiwitten met de lage pH aan
de anode (+).
Two-dimensional electrophoresis maakt gebruik van een combinatie van SDS-PAGE en isoelectric
focussing. Een monster wordt eerst gebruikt voor isoelectric focussing in een enkele baan. De baan
wordt vervolgens horizontaal op de SDS-PAGE kolom gezet. De eiwitten worden zo horizontaal op
lading en verticaal op massa gescheiden. Daarnaast kan ook de sterkte van de spots gebruikt worden
om monsters uit twee verschillende condities met elkaar te vergelijken. Door two-dimensional
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller FFV. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $3.22. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
73918 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now