Samenvatting Methoden in biomedisch onderzoek 3e bach - 90 pagina's
45 views 1 purchase
Course
Methoden in het biomedisch onderzoek 3
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Deze samenvatting is 90 pagina's lang. Dit document geeft je een goed overzicht en uitgebreide uitleg van alle methoden die gekend moeten zijn voor het examen. De samenvatting is gemaakt met alle info van de slides en alle notities van in de les. Geslaagd van de 1e keer.
Hoofdstuk 1: Inleiding: belang van methoden
Omics methoden: analyse van klasse van moleculen, bv. analyse van DNA (Sanger)
Sanger sequencing: methode om de 4 letters van ons DNA te kunnen lezen (duur en traag)
Next generation sequencing: voor ongeveer 1000 euro in een halve dag het genoom
sequencen enorme impact op de geneeskunde
Nanopore: op basis van stroomverandering afhankelijk van de letter dat passeert
sequentie van DNA in beeld brengen
Multi-omics: zo veel mogelijk klassen van moleculen data bij elkaar brengen en integreren
compleet mogelijk beeld van een organisme, van een ziekte
Bulk naar single cel:
- Bulk analyse: weefsel van bv. tumor van patiënt mixen alle klassen van
moleculen meten geeft heel veel info nadeel: output is een gemiddelde
van het ganse weefsel, dus je mist wat specifieke info
- Single cel: cellen uit het weefsel halen en los van elkaar halen omics uitvoeren op
aparte cellen veel meer en andere informatie Nadeel: ruimtelijke info
verloren door de cellen uit elkaar te halen (belangrijk voor therapie bepaling)
Single cell transcriptomics:
- Weefsel en cellen: sample preparatie en cellen worden uit elkaar gehaald
- Inkapsulatie: cellen worden in kleine druppeltjes gestoken, gescheiden door olie
- Proefbuisjes met cellen in druppels
- Beeldvorming: aparte cellen analyseren gelijkaardige cellen hebben zelfde kleur
Spatial omics: het fruit in de fruitmand laten en zo alles proberen analyseren zonder het uit
elkaar te moeten halen gedetailleerd beeld krijgen
- Weefsel op glazen plaatje plaat: spotjes met oligonucleotiden daar kunnen de
mRNA moleculen van het staal lokaal op binden via barcode alles sequencen
weten welk transcript op welke plaats liggen heterogeniteit in weefsel zien
- Alles krijgt een kleur en dan kan je alle verschillende celtypes bekijken die in dat
weefsel liggen
Massa spectrometrie imaging:
- Met laser op een weefsel schijnen, puntje per puntje moleculen komen vrij uit het
weefsel en komen in een lange buis verschillende snelheden door andere massa’s
- Heel weefsel afscannen en alle info bij elkaar leggen om een volledig beeld en analyse
te krijgen op moleculair niveau (op basis van verschillende kleuren)
Interactomics: interacties tussen moleculen bekijken, bv. interactie tussen DNA en eiwitten
Gentranscriptie: interactie tussen genfactoren bekijken + welke genen zijn wanneer actief
Pathway analyse en fluxomics: welke producten worden er allemaal gemaakt
1
,Genmodulatie:
- Je hebt een bepaald biomedisch probleem je gaat dat omicsen
- Identificatie van gen/proteïne/lipide dat veranderd is in de ziekte gen moduleren
om te kijken of dat gen een functie heeft in een ziekte bv. RNA interference en
CRISPR/Cas9
Synthetische biologie: nieuwe organismen maken die in de natuur normaal niet echt bestaan
Hoofdstuk 2: Analyse van DNA en genomics
DNA: drager van genetische informatie (A, T, C, G)
DNA quantificeren: concentratiebepaling OD 260/280 bepaling
3 generaties van DNA sequencing methoden:
- 1e generatie: Sangersequencing, je moet DNA kloneren en amplificeren, zodat je
voldoende kopies hebt om dit af te lezen dit gebeurt niet meer bij 2e en 3e
generatie (tijd besparen) analyse: elektroforese voor scheiding fragmenten
e
- 2 generatie: massief parallel sequencing, amplificatie in vitro voor meer signaal
miljoenen korte sequenties tegelijk meten bv. Illumina en Ion Torrent
e
- 3 generatie: next-next generation sequencing niet meer amplificeren, single
molecule gebruiken om de sequentie bepalen lange sequenties die je kan
doorlezen sneller, bespaart kosten
Human genome project:
- Bijna 1 volledig humaan genoom werd toen uitgelezen via Sangermethode
- 3 miljard dollar en 10 jaar geduurd (1990-2001)
- Zeer belangrijk voor biomedische kennis van nu
- Nu: nieuwe methode waarmee we op een paar uur tijd een genoom kunnen uitlezen
voor 1000 euro veel voordelen
De novo genoom sequencing:
- Sequentie bepalen van species waar we nog geen DNA sequentie van hebben
voor de eerste keer het genoom sequencen
- Dit moet vaak in stukken gebeuren, want anders is dit veel te groot waar overlap
zit, komen de stukjes overeen en zo kan je alle data samenleggen en aligneren
Resequencing:
- Een nieuw individu sequencen van een gekend species waar de sequentie al van
gekend is (er is een referentiegenoom in de databank)
- Aligneren met het referentiegenoom om de verschillende stukjes aan elkaar te zetten
Veel gemakkelijker dan de novo
- Verschillen tussen individuen bekijken (3 miljoen basen) SNP’s en mutaties (ziekte)
- Construct verificatie: verifiëren of de sequentie juist is
2
, - Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica (mensen reageren anders op
medicatie), NIPT test om chromosomale afwijkingen te bekijken bij embryo
Sequentiebepaling als teller:
- Aantal transcripten en aantal RNA moleculen meten in een cel
- Weten hoe vaak een bepaald gen tot expressie komt
Whole-exome sequencing: enkel alle coderende delen van het genoom sequencen (1,5%)
Targeted sequencing: bv. enkel het X-chromosoom sequencen, specifieke gewenste regio’s
1. 1e generatie sequentiebepaling
Maxam en Gilbert: chemische klieving methode (Geen examen leerstof)
- Stukje uiteinden DNA merken met radioactief gemerkt T4 kinase of radioactief
gemerkt ATP voor detectie P-groep (rood) gaat hangen aan beide 5’ uiteindes
- Beide uiteindes merken met hetzelfde radioactief label is onhandig om dan de
sequenties af te lezen, want je leest de 2 complementaire strengen tegelijk dus 1
uiteinde van de 2 strengen wordt weggeknipt door RE 1 gemerkte streng blijft over
- De moleculen verdelen over 4 buisjes, waar telkens een andere chemische stof inzit
breuk introduceren in sequentie na bv. af en toe een G je krijgt een mix
van fragmenten die eindigen op een G, maar met verschillende lengte
e
- 2 buisje: klieft specifiek na een A of een G
- 3e buisje: klieft specifiek na een C of een T
- 4e buisje: klieft specifiek na een C
- De reacties scheiden op polyacrylamide gel stroom moleculen van + naar –
pool kortere (onder) en langere (boven) fragmenten worden gescheiden
radioactieve bandjes te zien juiste sequentie aflezen (onder naar boven)
- Principe: differentiële chemische klieving van nucleïnezuren in 4 verschillende
reacties + scheiding volgens grootte op gel + visualisatie via autoradiografie
- Nadelen: +- korte fragmenten en niet zo specifiek sequentie niet altijd éénduidig
Sanger sequencing: nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
- Begin: template of matrijs amplificatie door PCR, of bacterie
- Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTP’s + ddNTP’s om nieuw DNA te maken
- Verhouding nemen van dNTP’s en ddNTP’s (bv. 1/100) ddNTP’s stoppen synthese
- De strengen met verschillende lengte worden gescheiden op een gel of capillair, zodat
je geautomatiseerd sequentie kan aflezen doordat 4 dNTP’s een kleur hebben (laser)
- Soms heeft het signaal probleem met veel herhalingen van basen, bv. CG-rijke regio’s
- Resultaat: elektroferogram, piekenpatroon met kleur gelinked aan de basen
- Kwaliteitscontrole: de eerste 30 basen laten we vaak weg, omdat er te veel fouten in
zitten software om alles uit te lezen + kwaliteitscode gebaseerd op probabiliteit
van foutieve basecall (Phred score Q = -10*log10(P) Q = 10, 90% accuraatheid)
- Mutatiedetectie: bv. 2 pieken tegelijk detecteren kan wijzen op een mutatie
3
, Verwezenlijkingen met 1e generation sequencing (Sanger)
- Human genome project
- Met mix van genomen van individuen door hiërarchische shotgun sequencing
Genoom werd opgedeeld in kleinere stukken en dat kloneren in YAC’s
Mappen en fragmenteren van genoom via Southern blotting (5 jaar)
Sequencen van die fragmenten
- Dit is het referentiegenoom van de mens geworden vaak updates, bv. hg38
Whole genome sequencing:
- Nieuw project opgestart toen human genome project nog bezig was
- Genoom van 1 persoon nemen, fragmenteren in kleine stukjes en dat volledige
genoom sequencen met supercomputer al die kleine sequenties terug aan elkaar
zetten (project zonder mapping)
- Via whole genome shotgun sequencing (Sanger)
Na afwerking van beide projecten (human genome en whole genome) konden de beide
sequenties vergeleken worden bevinding: 3 miljoen verschillen (SNP’s tussen mensen)
Enorme impact op:
- Technologische ontwikkeling van sequencing: automatisering (minder kosten en
meer sequentie data) en aanpak
- Grote ontwikkeling van bio-informatica
- Visie op delen van data (open science/data) data vrijgeven om anderen te helpen
- Andere methoden omdat nu bijna de volledige sequentie beschikbaar is
- Biologische kennis:
- Sequentie en organisatie van nagenoeg alle humane genen gekend
- Vergelijkende genomics: inzicht in evolutie, in geconserveerde processen
- Genetische verschillen tussen mensen, bv. SNP’s
Nieuwe uitdagingen:
- Volledige sequentie: telomeer tot telomeer
- Meer genomen sequencen van meerdere species
- Meer individuele humane sequenties: nu al duizenden gedaan
- Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
Enorme mogelijkheden voor ‘personalized precision medicin’:
- Kennis van DNA volgorde en SNP’s diagnose, prognose en preventie
- Farmacogenomics: verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen goed of
slecht reageren op geneesmiddelen enorme impact op industrie
- Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen (diabetes, kanker)
- Therapie op maat, bv. al bij kanker
Probleem met standaard Sanger sequencing: throughput en kosten er is verbeterde en
andere technologie nodig met hoge capaciteit en lage kosten
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller sarahvcr. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $13.45. You're not tied to anything after your purchase.
