VOLLEDIGE samenvatting Methoden 3 (KULAK) - alle proffen
13 views 0 purchase
Course
Methoden in het biomedisch onderzoek 3 (U03D8A)
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Dit document vat het volledige vak Methoden 3 praktisch samen. Bevat informatie uit de Powerpoints van de hoorcolleges en informatie uit de lessen zelf. Naast tekst ook figuren om alles visueel voor te kunnen stellen.
1 Kernthema’s
1) Van 1 molecule naar omnics (bv. 1 gen naar hele genoom) = nanopore sequencing,
next generation sequencing,…
2) Multiomnics = op meerder niveaus analyse
3) Van bulk naar single cell = Bulk: bv. heel weefselbiopt (heterogeen) meten (in de
blender) (Transcriptomics, Proteomics) geeft weinig inzicht terwijl bij single cell je per cel
analyses doet (bv. cellen met trypsine losmaken, elk in een droplet brengen en dit dan
onderzoeken).
4) Van single cell naar spatial omics = waar in ruimte bevindt zich iets? (niet enkel
informatie welke cellen er zich bevinden, maar ook op welke plek). Kan handig zijn voor
visualisatie op een biopt waar bepaalde cellen zitten met bepaalde kenmerken.
Methoden 3 = beetje meerkeuze (detailvragen -> enkel over methoden 3), open vragen (gaan ook gaan over
methoden 3) en mondeling vraag (gaat specifiek over heel de cursus -> 10/15 min uitleggen)(beoordeeld enkel wat
je zegt)(stel je bent fout, polst hij nog over een andere oplossing)
Mondeling: probleem oplossen. Gaat over algemene kennis. Bv. ziekte om mitochondriale afwijking te bekijken,
hebben dit via fluorescentie microscopie geprobeert maar lukt niet. -> kunt zeggen kan via superresolutie
microscopie -> voorbeeld (+ principe)
Staal waar je DNA sequentie wilt doen -> hoe doe je dit? Extraheren (hoe?)
Mondeling is minder dan kwart van de punten.
,H2 – DNA en genomics
1 DNA sequentiebepaling
1.1 Inleiding
1st generation (Sanger) = kloneren (plasmide) in bacterie (nu PCR) en elektroforese ->
gouden standaard voor kleine projecten maar voor grote duurt het te lang. Bv.
2nd generation (Illumina, Ion Torrent) = massief parallel sequencen (miljoenen
verschillende kleine sequenties in 1 keer) van klonaal in vitro geamplificeerde DNA
moleculen (dus zonder bacterie). Dit is sneller en goedkoper. Nadelen = korte sequenties
+ bij sommige toestellen is accuraatheid een probleem (moeilijker voor mutaties).
3rd generation (Nanopore, Pacific Biosciences) = geen amplificatie vereist (lange
sequentie/single molecule sequencen). Amplificatie is niet altijd even juist dus dit
elimineert deze factor. Is sneller en goedkoper.
Toepassingen:
- De novo genoom sequentiebepaling (eerste keer/nieuwe sequentie gedeeltelijk of
volledig sequeneren, bv. COVID). Nadeel = kleine sequence stukjes moet je aan elkaar
hangen (computer kijkt naar overlappende eindjes) maar daar zitten gewoonlijk gaten in.
- Resequencing = sequentie van een nieuwe individu/patiënt op referentiegenoom
mappen (SNP’s, mutaties, diagnose, NIPT voor chromosomale afwijkingen kind).
Voordeel = makkelijk om kleine sequence stukjes op het volledig genoom te mappen.
- Sequentiebepaling als teller = aantallen DNA/RNA moleculen (bv. hoeveel keer komt
een gen tot expressie -> hoeveel RNA bv. RNAseq)
=> WGS (whole-genome sequencing), WES (whole-exome sequencing -> enkel
interesse in coderende sequentie wat 1,5% is van genoom = tijdswinnend) of targeted
sequencing (specifieke gewenste regio’s). Transcriptoom: RNA -> cDNA (interesse in
RNA sequentie).
1.2 1ste generation sequencing
Had impact op biologische kennis (sequentie en organisatie van bijna alle humane genen
gekend, inzicht in de evolutie, genetische verschillen tussen de mens,…) en ontwikkeling
bioinformatica. Mogelijkheden voor personalized precision medicine (therapie op
maat bij kanker bv., inzicht in complexe aandoeningen zoals diabetes en kanker,
verklaren en voorspellen of bepaalde individuen goed/slecht reageren op een GM ->
farma-industrie, kennis van volgorde en SNP’s helpt in de diagnose/prognose/preventie).
,H2 – DNA en genomics
1.2.1 Sanger sequencing
= nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie -> template (DNA sequentie) is een
gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt (klassiek kloneren in bacteriën of
PCR).
Tijdens amplificatie = polymerase (thermostabiel en kunnen zowel d als dd inbouwen) +
primer + 4 DNTP’s en ddNTP’s (elk met verschillend fluorescent label, missen 3’ OH
groep welke de fosfodiesterverbinding normaal maakt in DNA keten). Reactie van keten
stopt na inbouwen ddNTP. Verschillende lengtes worden gescheiden op gel/cappilair
(eerste de kleine fragmenten) -> elektroferogram. Eerste 30bp niet afleesbaar, beperkt
tot 500-1000 bp + moeite aflezen van regio’s met herhalingen of GC-rijke regio’s
(plakken sterk aan elkaar door 3 bindingen dus moeilijker te interpreteren) = overlap.
Software leest dit af met kwaliteitsscores (Phred-score, moet min. 20 zijn anders is de
waarschijnlijkheid dat je een foutieve base afleest te hoog -> overlap). Hoe hoger de
score hoe lager de kans. Voor betrouwbaarheid = 2 aparte reacties met FW en RV primer
om beide richtingen te lezen.
N -> te lage betrouwbaarheid dus computer kan geen juiste
letter toegeven. Oplossing = FW of RV sequentie nemen.
Wordt ook gebruikt om mutaties te detecteren (2 piekjes, soms is dit ook een
sequentiefout -> reverse bekijken of dit daar ook is).
Nadeel = lage throughput (aantal reads per dag) en hoge kosten.
1.3 2nd generation sequencing: short-read NGS
Doel = veel hogere throughput (massale DNA sequentiebepaling mogelijk -> 1 humaan
genoom op 1 toestel/dag) en veel lagere kosten:
- Parallelle detectie = klonale in vitro amplificatie van een korte template ->
duizende/miljoenen kopieën van DNA template per cluster. Multiplexing = vele clusters
tegelijk (veel templates/reactie ivm. 1 template/reactie).
- Miniaturisatie van reacties (minder kosten)
- Integratie van het proces -> directe detectie (ivm. scheiding via gelektroforese)
Voorbeelden = Roche, Illumina, Ion Torrent,…
, H2 – DNA en genomics
1.3.1 Stap 1 - Aanmaak NGS DNA library
= fragmentenbank (verzameling te sequencen templates).
Soorten library afh. van analyse:
– WGS
– Mate pair library (zie verder)
– WES of targeted sequencing (hierbij wil je alle andere sequentie weg wat kan via
hybridisatie aan probes op beads of een plaat + ongebonden wegwassen OF gebruik
veel primers die gericht zijn aan enkel exonsequenties -> enkel amplificatie
exonsequenties bij PCR)
– Amplicon sequencing (stukje DNA wat afkomstig is van PCR) Stappen kunnen opnoemen op
examen (gel, NaCl,…)!
– cDNA library (RNA-seq, zie volgend hoofdstuk)
1) Input DNA (heb je bereid) ondergaat eerst kwaliteitscontrole
(concentratie, zuiverheid via A260/280 en A260/230,….)
2) Random fragmentatie via sonicatie, Dnase, nebulisatie (onder
hoge druk vloeistof met DNA door klein gaatje spuiten, hoe hoger
de druk hoe kleiner de fragmenten),…. = fragmenten die
overlappen -> makkelijker om aan elkaar te plakken achteraf
(niet via RE = overlappen minder). Daarna nazien op gel +
concentreren met NaCl/EtOH (zie methoden 2) => size
selection + extractie = gewenste lengte fragmenten selecteren.
Kan via gel-elektroforese + uitknippen gewenste bandjes
OF via magnetische beads die DNA binden (verhouding
DNA/beads bepaalt gebonden lengte -> 1zijdig = korte
fragmenten zoals adapter-dimeren wegfilteren of 2zijdig =
wegfilteren kleine en te grote fragmenten). Weinig beads =
binding lange fragmenten + weggooien, daarna meer beads =
binding korte fragmenten en dit behouden (aller kortste
weggooien).
3) End repair = blunt ends maken (geen overgang 3’ of 5’
strengen via DNA polymerase en klenow fragment) + 5’ uiteinde
fosforyleren (kinase) en via Taq polymerase een 3’ A aanhechten
(nodig voor binden met adapter die een T bevat)
4) Ligatie adapters die nodig zijn voor -> plaats waar primers
binden voor PCR en sequencing (zo krijgen alle random
fragmenten eenzelfde primerplaats voor 1 primer) + barcode
(per staal/molecule, zelfgekozen sequentie). Eventueel kunnen er
verschillende adaptoren gebruikt worden per fragment (zie
verder).
Ligatie van 2 verschillende adaptoren kan bv. doordat de ene
adaptoren biotine bevat wat met een avidine bead gaat binden
(hier rode adaptor). Strengen met 2 groene gaan niet binden =
wegwassen. Wat aan de bead hangt denatureer je waardoor
enkel de losse fragmenten (met groen en rood) loskomen welke
je kan elueren (de vaste zijn niet van belang). (examen!)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller robindhaeyer. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $16.25. You're not tied to anything after your purchase.
