Class notes
Hoofdstuk 8: Immunoassay
- Course
- Institution
Dit zijn mijn college aantekeningen van hoofdstuk 8. Heel handig om zelf een samenvatting van te maken!
[Show more]
Seller
Follow
lisaankersmit
Reviews received
Content preview
Hoofdstuk 8: Immunoassays Immunoassay’s worden gebruikt als eerste lijn om te zien of dat er in een bepaalde richtingdienst gezocht te worden naar analieten. Immunoassays zijn snelle en eenvoudige methoden
(denk bijvoorbeeld aan de zelftest voor bHCG of COVID-19). Om deze assays uit te voeren, is
er geen bijkomende expertise nodig, wat bijvoorbeeld wel nodig is bij chromatografie. Dit
soort testen geven een indicatie van de aanwezigheid van een bepaalde klasse drugs,
bijvoorbeeld amfetamines, barbituraten, morfine of codeïne, etc. Er zijn altijd kruisreacties
mogelijk, het is dan ook geen confirmatie techniek, waardoor er altijd extra confirmatie
testen moeten gebeuren om daadwerkelijk een drug te identificeren.
De detectie is afhankelijk van het type antilichaam dat wordt gebruikt. Immunoassays maken
gebruik van antilichamen om specifieke stoffen (analieten) in een monster te detecteren. De
effectiviteit en nauwkeurigheid van de detectie zijn sterk afhankelijk van het type
antilichaam dat wordt gebruikt. De affiniteit (hoe sterk het antilichaam bindt) en de
specificiteit (hoe goed het antilichaam de juiste stof kan onderscheiden van andere stoffen)
van het antilichaam bepalen hoe goed de immunoassay het analiet kan detecteren.
Verschillende antilichamen kunnen variëren in hun vermogen om onderscheid te maken
tussen verschillende maar chemisch verwante stoffen.
Er kan dan ook moeilijk uitgewisseld worden met andere matrices. Een matrix verwijst naar
het type monster waarin de detectie wordt uitgevoerd (zoals bloed, urine, speeksel, haar of
weefsel). Een matrix specifieke methode betekent dat de immunoassay is ontwikkeld en
geoptimaliseerd voor een specifiek type monster. Dit is belangrijk omdat de samenstelling
van de matrix (bijvoorbeeld aanwezigheid van eiwitten, vetten of enzymen) de prestaties van
de immunoassay kan beïnvloeden. Verschillende matrices kunnen verschillende
interferenties veroorzaken, waardoor de assay mogelijk moet worden aangepast om
betrouwbaar te werken in die specifieke matrix. Dit kan inhouden dat er extra stappen
worden toegevoegd aan de voorbereiding van het monster of dat er speciale antilichamen
worden gebruikt die beter werken in de specifieke matrix.
Principe
De binding tussen het antigen en het antilichaam verloopt homogeen en kan in een 1- of in
een 2-staps methode uitgevoerd worden. Bij de 1-staps methode wordt het staal
geïncubeerd met het antilichaam in een buffer en kan men het resultaat aflezen. Bij de 2-
staps methode wordt eerst het staal toegevoegd zodat het kan binden met het antilichaam.
Dit wordt gewassen en eventueel kan er een tweede antilichaam aan toegevoegd worden
(denk aan ELISA). Hierna kan pas het resultaat worden afgelezen.
In een competitieve immunoassay concurreren het analiet in het monster en een gelabeld
analiet (een standaard) om de binding aan een beperkte hoeveelheid antilichamen. Hoe
meer analiet er aanwezig is in het monster, hoe minder gelabeld analiet er kan binden aan
de antilichamen. De hoeveelheid gebonden gelabeld analiet wordt gemeten. Er is dus een
inverse relatie tussen de signaalsterkte en de concentratie van het analiet in het monster.
Een voorbeeld hiervan is ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) of RIA
(radioimmunoassay). In een niet-competitieve immunoassay wordt het analiet in het
monster eerst gebonden door een antilichaam (of een reeks antilichamen) zonder
competitie van een gelabeld analiet. De signaalsterkte is dan direct gerelateerd aan de
Pagina 1 van 13 hoeveelheid analiet in het monster. Een voorbeeld hiervan is sandwich ELISA of
immunoassays met chemiluminescentie of fluorescerende detectie in een niet-competitief
formaat.
Aspect Competitieve immunoassays Niet-competitieve immunoassays
Binding Analiet en gelabeld analiet concurreren om binding aan antilichamenAnaliet bindt eerst aan een capture-
antilichaam, gevolgd door detectie met een tweede gelabeld antilichaam
Relatie tussen signaal en analietInverse relatie
(meer analiet minder signaal)Directe relatie
(meer analiet meer signaal)
Complexiteit Vaak eenvoudiger, minder stappenVaak complexer, meer stappen en hogere gevoeligheid
Gebruik Geschikt voor kleine moleculen, lage moleculaire gewichtenGeschikt voor grotere moleculen, eiwitten, hormonen
Detectiemethoden – EMIT De detectiemethoden van immunoassays zijn een enzymatische reactie (UV), turbidimetrie
of fluorescentie. De enzymatische reactie gebruikt een enzym dat is gekoppeld aan een
antilichaam of antigeen. Dit enzym katalyseert een reactie waarbij een substraat wordt
omgezet in een product dat UV-licht absorbeert. Een voorbeeld hiervan is ELISA, waarbij een
enzym zoals peroxidase wordt gebruikt. Een voorbeeld die in de les werd getoond is EMIT
(enzyme multiplied immunoassay technique).
Dit is een competitieve immunoassay die
gebruik maakt van een enzym-gekoppeld analiet
en specifieke antilichamen om de concentratie
van een analiet in een monster te meten. Het
monster, dat het te meten analiet bevat, wordt
gemengd met specifieke antilichamen en een vastgestelde hoeveelheid van het analiet
gekoppeld aan een enzym. Het analiet en het enzym-gekoppelde analiet concurreren om de
bindingsplaatsen op de antilichamen. Wanneer de antilichamen binden aan het enzym-
gekoppelde analiet, wordt de enzymactiviteit geblokkeerd. Wanneer het analiet aan de
antilichamen bindt, blijft het enzym-gekoppelde analiet vrij en actief. Een specifiek substraat
voor het enzym wordt dan toegevoegd. Het actieve enzym zet dit substraat om in een
product dat gemakkelijk gemeten kan worden (meestal via spectrofotometrie). De
hoeveelheid gevormd product is direct evenredig met de concentratie van het vrij enzym-
gekoppelde analiet, en dus omgekeerd evenredig met de concentratie van het analiet in het
monster. EMIT wordt vaak gebruikt voor drugstesten, zoals het detecteren van drugs in
urine.
Een voorbeeld van een enzym kan glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6P-DH) zijn. Dit
oxideert het substraat glucose-6-fosfaat en reduceert ook de cofactor NAD tot NADH. De
activiteit van het enzym kan spectrofotometrisch worden gemonitord door het
geproduceerde NADH te meten bij een golflengte van 340 nm. In EMIT, bij afwezigheid van
de doelwitdrugs in het monster, vertoont het enzym, dat gebonden is aan het antilichaam,
geen activiteit. In aanwezigheid van de doelwitdrug wordt het enzym vrijgemaakt van het
antilichaam en vertoont het zijn activiteit. Hoe meer drugs aanwezig zijn, hoe meer enzym
wordt vrijgemaakt en hoe hoger de toename van NADH-absorptie is bij 340 nm.
Pagina 2 van 13
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lisaankersmit. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $12.36. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
52355 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now