Summary
Samenvatting Moleculaire genetica: H3. moleculaire diagnostiek
- Course
- Institution
Een samenvatting van het derde deel van moleculaire genetica (apart examen). Met voorbeelden!
[Show more]
Seller
Follow
nimarnatin
Content preview
3. Moleculaire diagnostiek1. Analysemethoden voor nucleïnezuren: cytogenetische onderzoeksmethoden
Karyotypering = de chromosomenkaart waar alle chromosomen op gerangschikt zijn
→ Hoe bekomt men dit?
Meestal wordt het op perifere bloedmonocyten (PBMC) gedaan
→ Kan ook op beenmerg, geweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of
chorionvilli (uitsteeksels van de placenta)
Proces:
1) Er wordt 5 – 10mL bloed afgenomen in een heparine buisje
2) Er wordt fytohemagglutinine (een hormoon) aan de cellen toegevoegd
→ Gevolg: de T-lymfocyten worden gestimuleerd om te delen
3) Na 48 – 72u wordt er colchicine toegevoegd
→ Colchicine interfereert met de vorming van de spoeldraden
→ Gevolg: de celdeling wordt gestopt in de metafase (of vroeger voor een betere
resolutie (tussen profase en metafase))
4) Er wordt een hypotone oplossing aan de cellen toegevoegd
→ Gevolg: de cellen zwellen op + de individuele chromosomen worden gescheiden
5) Fixatie op een microscoopglaasje + Giemsa kleuring
→ Met een lichtmicroscoop worden de cellen bekeken
Voor routine karyotypering wordt gebruik gemaakt van een Giemsa kleuring
→ G-banding of Giemsa banding = de karakteristieke alternerende lichte en donkere bandjes van een
chromosomenpaar
➔ De donkerere bandjes:
- Bevatten relatief weinig actieve genen
- Zijn A-T rijk
- Repliceren laat in de S-fase
➔ De lichte bandjes:
- Bevatten ± 80% van de actieve genen (waaronder alle huishoudgenen)
- Zijn relatief G-C rijk
- Repliceren vroeg in de S-fase
De flow karyotypering heeft een betere resolutie
→ ➔ Chromosomen gekleurd met een fluorescerende
kleurstof passeren de laserstraal van een flow cytometer
→ De lichtverstrooiing wordt opgenomen door een
photomultiplier tube (PMT)
➔ Hoe groter het chromosoom, hoe groter het signaal
➔ Het gemiddelde van elke piek = de relatieve DNA
inhoud van een bepaald chromosomenpaar
➔ Het oppervlak onder elke piek = het relatief aantal
chromosomen in elke groep
➔ Om variatie in individuele chromosomen na te
gaan + voor identificatie van chromosoomafwijkingen
,2. Analysemethoden voor nucleïnezuren: moleculaire onderzoeksmethoden
Voor moleculaire onderzoeksmethoden moet DNA en RNA geïsoleerd worden uit materiaal van de
patiënt die wordt gebestudeerd
➔ Bij moleculaire onderzoeksmethoden zijn geen delende cellen nodig → handig!
Isolatie van mRNA:
➔ De meeste mRNA’s bezitten een poly(A)-staart aan het 3’-uiteinde
→ Dit kan men gebruiken om via een poly(T)-oligonucleotide de mRNA’s
op te vissen
---> De poly(T)-staarten worden gekoppeld op magnetische beads om
de isolatie te verbeteren
➔ mRNA wordt geïsoleerd om het expressiepatroon van 1 cel- of weefseltype
te bestuderen
→ Het transcriptoom = de volledige set mRNA van 1 cel of 1 weefseltype
➔ De bekomen pure mRNA kan gemeten worden met een spectrofotometer
of gescheiden worden met een gelelektroforese
Isolatie van RNA:
➔ Organische extractie:
Het staal wordt in een fenoloplossing gebracht en gecentrifugeerd
➔ RNA’se-vrij werken + het gebruik van RNA’se-remmers is noodzakelijk
→ RNA’se zit op onze handen en breekt RNA af
---> Daarom handschoenen dragen!
Isolatie van DNA:
Via denaturatie en extractie
→ M.b.v. zouten worden eiwitten gedenatureerd en hoogmoleculaire nucleïnezuren in
oplossing gehouden
---> Nadien wordt ijskoude ethanol toegevoegd om het DNA te doen neerslaan
---> Deze opeenvolging van stappen noemt men ‘differentiële precipitatie’
Door adsorptie op silicadeeltjes waaraan DNA blijft plakken
Door filtratie over een semi-permeabel membraan
DNA en RNA vertonen significante UV-absorptie bij 260nm
Eiwitten hebben een optimale absorptie bij 280 nm
➔ De verhouding A260nm/A280nm geeft informatie over de zuiverheid van een
nucleïnezuurpreparaat
, M.b.v. fluorescerende DNA- en RNA-kleurstoffen kan de concentratie van DNA in een oplossing
gemeten worden
➔ De meest bekende kleurstof is ethidiumbromide (EtBr)
→ Dit is kankerverwekkend en kruipt tussen DNA-moleculen
→ Alternatieve kleurstof: SYBR green
---> Dit kruipt ook tussen DNA-moleculen maar is vele veiliger dan EtBr
DNA- en RNA-moleculen kunnen d.m.v. gelelektroforese worden gescheiden
➔ Door de negatief geladen fosfaatgroepen bewegen nucleïnezuren zich bij neutrale/basische
pH in een elektrisch veld altijd naar de positieve pool
➔ De migratiesnelheid is afhankelijk van:
➢ Het type gelmatrix → agarose matrices of polyacrylamide matrices (betere resolutie)
➢ De grootte van de poriën
➢ De moleculaire afmetingen van het nucleïnezuur
➢ De conformatie van het nucleïnezuur
➔ Agarose wordt geïsoleerd uit zeewier
→ Hoe hoger de concentratie, hoe fijnmaziger het netwerk en hoe moeilijker nucleïnezuren
in de agarosegel kunnen migreren
DNA-gelelektroforese:
➔ Links: de lengtemarker
➔ Midden: DNA dat geknipt is met 3 verschillende restrictie-enzymen
➔ Rechts: controle DNA → is niet geknipt!
RNA-gelelektroforese:
➔ De 28S en 18S rRNA bandjes zijn zichtbaar
➔ Staal 1 en 2 zijn de beste stalen!
➔ gDNA = genomisch DNA
→ Als je met RNA werkt wil je geen DNA meer dus staal 5 is
een slecht staal
➔ Witte bandjes = rRNA (ribosomaal RNA)
→ De ‘smeer’ ertussen zijn allerlei lengtes van mRNA
➔ Staal 3 is een voorbeeld van gedegradeerd RNA met een RNA
smeer onder de 28S en 18S rRNA bandjes
➔ Staal 4 is een voorbeeld van RNA degradatie die resulteert in
verlies van de 28S rRNA band en een opstapeling van
gedegradeerd RNA onderaan de gel
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller nimarnatin. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $15.58. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
73091 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now