College aantekeningen Moleculaire celbiologie (I0O14A)
16 views 0 purchase
Course
Moleculaire celbiologie (I0O14A)
Institution
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Uitgewerkte cursustekst gebaseerd op de college-aantekeningen van de cursus Moleculaire celbiologie, van Jan Michiels. Deze uitgebreide tekst bevat alle informatie die op de slides is behandeld, aangevuld met extra notities uit de lessen. Het document is overzichtelijk gestructureerd met een duide...
Doelstellingen
• Kennis en inzichten in de werking op moleculair niveau van cellen en experimentele benadering.
• Algemene principes van de moleculaire basis van celstructuur en cel functie, signaaltransductie en controle
van genregulatie, celcyclus, cel communicatie, cel differentiatieprocessen.
Examen
• Kennisvragen (globale, specifieke)
• Inzichten in celstructuur, celfunctie en celregulatie
• Inzichten in experimentele benadering
• Zie modelvragen
Context
Belang van Moleculaire Celbiologie binnen de opleiding Cel- en Gentechnologie
Bijna uitsluitend over eukaryote cellen
Studiemateriaal
• Handboek, presentaties, oefeningen (tijdens de lessen op het bord)
• Enkel kennen wat in de lessen wordt gezien
Begeleiding
• Vragen of problemen met betrekking tot de leerstof
• Voorbereiding lessen thuis
Overzicht cursus (3 delen)
1. DEEL II: De flow van genetische informatie
2. DEEL III: Cel-structuur en -functie
3. DEEL IV cel-regulatie
1
Kirsten Van Gils (2022)
,DEEL II: DE FLOW VAN GENETISCHE INFORMATIE
H7: REPLICATIE, ONDERHOUD EN HERSCHIKKING VAN GENOMISCH DNA
INTRODUCTION
• Bij elke celdeling wordt het volledig genoom gedupliceerd
- Semi-conservatief: kopij van de twee strengen
• Een enzyme-complex is vereist om de grote DNA moleculen die prokaryote en eukaryote chromosomen
uitmaken, correct te repliceren.
- Enzyme -complex: DNA polymerase, polymeriseert en maakt DNA aan. Dit is noodzakelijk, cel kan niet
leven zonder. Aanwezig in alle soort cellen.
- Proefleesactiviteit: kijken of het wel het juiste nucleotide is. Zorgt voor een lage fequentie van fouten. Dit
is noodzakelijk voor celproductie. De meeste mutaties zijn namelijk nadelig. Veel mutaties in kiemcellen
leidt tot het verdwijnen van de soort. Veel mutaties in somatische cellen leidt tot het sterven van het
individu. Dit is echter niet voldoende, hele reeks andere systemen aanwezig.
- DNA-herstelmechanismen (→kanker)
Ouder streng en de dochter streng, ze moeten de dochter streng corrigeren en niet de ouder streng.
Systemen om dochter en ouder van elkaar te kunnen onderscheiden.
Heel wat klassieke chemische reacties kunnen optreden in de cel, dit moet herstelt worden.
Stel heel wat extensieve schade bv. Breuken in het DNA, er zijn mechanisme zoals homologe recombinatie
die dit soort breuken kan oplossen. Stel je wordt bestraald door X stralen kan je breuken krijgen. We zijn
diploïde, als een kopij schade heeft ondervonden gaat het de informatie van het ander kopij afschrijven.
Bij meiosie gebeurd er ook homologe recombinatie om variatie te krijgen. Het is eigenlijk een proces dat
oorspronkelijk is ontstaan voor herstelmechanisme.
In deze cursus niet verder over herstelmechanisme ingaan
• Opdat species kunnen evolueren, zijn recombinatie tussen homologe chromosomen, mutaties en
herrangschikkingen noodzakelijk om de genetische variatie tussen individuen te behouden.
- Mutaties
- Homologe recombinatie
- Balans tussen behoud en variatie van genetische informatie is cruciaal voor de ontwikkeling van een
individu en de evolutie van een soort
• 4 basen van DNA (moet je voor dit vak niet kunnen
tekenen)
• 2 strengen in anti-parallelle conformatie aanwezig. Ze
hebben een richting in DNA (5’-3’ uiteinde). Dit principe is
enorm belangrijk! DNA heeft dehydroxyribose, terwijl
RNA hier wel een hydroxyl groep heeft. De hydroxyl
groepen zijn reactief, terwijl DNA enorm stabiel is. Dit is te
wijten door de afwezigheid van de hydroxyl groepen.
Stabiliteit heeft ook te maken met de dubbelstreng, dit
beperkt de toegang voor enzyme. Suiker, fosfaat en
nucleotide.
• Pyrimidine (cytosine en thymine) en purine (guanine en
adenine)
• Major en minor groove. De major groove laat het best de
interactie tussen eiwitten en base toe.
2
Kirsten Van Gils (2022)
,7.1. DNA REPLICATIE
7.1.1. DNA polymerase
• DNA-polymerase: enzyme dat de synthese van DNA katalyseert
• DNA-polymerase kennen heel belangrijke biologische toepassingen zoals PCR.
• Arthur Kornberg, 1956, 3.coli DNA pol I
• Prokaryote en eukaryote cellen bevatten verschillende DNA-polymerases die verschillende functies hebben
in DNA-replicatie en herstel
• Twee fundamentele eigenschappen van alle DNA-polymerases:
• Alle polymerases synthetiseren DNA enkel in de 5 tot 3 richting
• Synthese gebeurd in 5’-3’ richting! Dit wilt
zeggen dat aan 3’ telkens een nieuw
nucleotide wordt gekoppeld een NTP
nucleotide. NTP zijn energierijk, er is een
hydrolyse reactie waar een pyrofosfaat wordt
afgesplitst dit levert de energie tussen de
koppeling van de nucleotide. De energie
komt van buiten af, zit niet in het DNA al in.
Moest het energie al in het DNA zitten, zou je
de capaciteit voor DNA polymerase
verwijderen.
• DNA-polymerases kunnen een nieuw
deoxyribonucleotide enkel toevoegen aan
een voorgevormde primer die is H-gebonden
op de matrijs
• DNA polymerase hebben altijd een primer
nodig! Ze hebben de 3’ hydroxyl uiteinde
nodig! Dit heeft ook te maken met de
proefleesactiviteit, feit dat het weinig fouten
introduceert in het DNA.
• Bacteriën: DNA-polymerase III belangrijkste voor DNA-replicatie
• Eukaryoten: 3 DNA polymerases (α, δ, ε) voor replicatie van nucleair DNA en γ gelokaliseerd in de
mitochondri
3
Kirsten Van Gils (2022)
,7.1.2. De replicatie vork
Replication of E.coli DNA
• Groeien van E. coli in aanwezigheid van radioactief thymidine
laat visualisatie toe van nieuw gerepliceerd DNA na
autoradiografie.
• Replicatievork: radioactief thymidine toegevoegd aan de
bacterie. Bacterie nemen het thymidine op en maken er NTPs
van, gaan dit inbouwen op het DNA, op de plaats waar DNA
synthese is. Zo de plaats van DNA synthese bekijken.
Radioactieve methode is enorm gevoelig maar ook gevaarlijk.
• John Cairns, 1963
• Replicatievork: regio van DNA-synthese waar de ouderstrengen uiteengaan en twee dochterstrengen
worden verlengd
• Regio van actieve DNA-synthese
• Eén enkele streng wordt gesynthetiseerd op een continue manier
• Wat met de andere streng? Zie verder
• Via elektronen microscoop bekijken.
• Het is hier dubbel radioactief, kijken naar de tweede deling. Dubbel streng DNA, 2 ouder strengen van elkaar
gescheiden en de dochter streng weergegeven. De replicatievorken gaan de andere richting uit,
bidirectioneel, dit gaat sneller. Echter dit is niet altijd zo, op alle systemen bestaat een uitzondering. Je hebt
hier wel 2 primers nodig.
Synthesis of leading and lagging strands of DNA
• Leidende streng: Continue DNA synthese in de richting van beweging van de replicatievork.
• Vertraagde streng: DNA synthese tegengesteld aan de richting van beweging van de replicatievork, door
ligatie van Okazaki fragmenten (1-3 kb)
• Okazaki fragmenten: korte stukjes van nieuw gesynthetiseerd DNA die verenigd worden tot een nieuwe
intacte DNA streng.
• Korte RNA fragmenten dienen als primer voor DNA replicatie
• DNA ligase is een enzyme dat breuken in het DNA verenigd
Ouderstrengen in blauw weergegeven, groen is nieuw DNA. Nieuw aangemaakt DNA is 5’-3’. De leidende streng
kan gewoonweg blijven syntheseren. Dit is verschillend bij de lagging strand. Synthese gebeurd hier ook 5’-3’.
Het probleem is telkens wanneer de vork opengaat moet nieuw stukje DNA aangemaakt, telkens nieuwe primer
nodig om op te starten. Dit worden de Okazaki fragmenten genoemd, 1-3kb groot. De vertragende streng wordt
met stukjes aangemaakt.
DNA ligase koppelt 5’ met 3’ uiteinde, het sluit het DNA op die korte stukjes telkens.
4
Kirsten Van Gils (2022)
,initation of okazaki fragments with RNA primers
Alleen RNA polymerase kan aan initiatie doen Dit is het
meest gekend voor de normale mRNA molecule. Bij DNA
synthese wordt dit een primase genoemd. Wanneer de
primer is aangemaakt kan DNA polymerase overnemen. Je
hebt een hybride molecule RNA-DNA. Het gevaar hier is dat
RNA niet zo fouten vrij is als DNA. Het heeft een groter
mutase frequentie. Het RNA moet dus verwijderd worden
en DNA moet aangemaakt worden.
• Primase is een enzyme dat korte RNA fragmenten synthetiseert (3-10 nucleotiden lang) complementair aan
de matrijsstreng nabij de relicatievork
• Je hebt een nuclease nodig: dit is een enzyme dat nucleotide of nucleotidepolymeren gaat afbreken. Twee
soorten exo en endo.
• Endonuclease kunnen splitsen in een DNA molecule. Restrictie nuclease zijn endonuclease. Dit hebben we
hier niet nodig.
• Exonuclease gaat DNA afbreken van de uiteinde. Je hebt 5’-3’ exonuclease. Je hebt ook exonuclease die 3’-
5’ zijn. Die gaan van de andere richting afbreken. Deze zijn potentieel gevaarlijke enzyme, vanaf het uiteinde
van DNA niet beschermd is kan het afgebroken worden door exonuclease. Eukaryote chromosomen zijn
lineair en hebben beschermde uiteinde hiervoor.
• Bacteriën: DNA-pol I, 5’-3’ exonuclease activiteit vanaf de uiteinden van Okazaki fragmenten
• Eukaryote cellen: gecombineerd RNase H (enzyme dat de RNA streng van RNA-DNA hybriden afbreekt) en
5 tot 3 exonucleases.
• Openingen worden ingevuld door polymerase δ en gesloten door DNA-ligas
removal of RNA primers and joining of okazaki fragment
Exonuclease die 5’-3’ gaat afbreken. Vervolgens
moet dit worden ingevuld. Bij bacteriën is dit
DNA polymerase I terwijl bij eukaryote is dit
RNaseH + 5’-3’ exonucleases + DNA-pol delta.
RNaseH breekt af van een dubbelstreng.
5
Kirsten Van Gils (2022)
,roles of DNA polymerases in E.coli and mammalian cells
• Bij E.coli de leidende streng synthese gemakkelijk. Bij zoogdieren is de leidende streng polymerase epsilon.
• Lagging strand synthese bij eukaryote heb je een complex hier. Dit gaat 50-100 nucleotide polymeriseren en
uiteindelijk overgenomen door delta. Dan moet het eerste stukje nog verwijderd worden.
Polymerase accessory proteins
• E. coli DNA pol III en eukaryote polymerases δ en ε zijn
geassocieerd met:
• Sliding-clamp proteins: ‘proliferating cell nuclear antigen’
(PCNA) in eukaryoten
• PCNA clamp: circulaire structuur die het DNA gaat
omklemmen. Dit moet eerst opengemaakt worden, rondom
DNA plaatsen en dan associëren met polymerase. Nodig voor
de progressiviteit van DNA polymerase, in staat om zeer lange
stukken DNA aan te maken zonder van het DNA af te vallen.
Zonder clamp is er dissociätie en diffusie na 20 -100 bp.
Verhogen de activiteit van DNA polymerase δ Zonder:
dissociatie en diffusie na 20-100 bp: processief
• Geconserveerd in virussen, bacteriën, gist, mens: Zesvoudige
symmetrie, zelfde diameter
• Laden polymerase op de primer en houden stabiele associatie
met matrijs
• Clamp-loading proteins: ‘replication factor C’ (RFC) in eukaryoten: katalyseren openen en plaatsen van
sliding clamp rondom primer:matrijs juncties door ATP-binding en ATP-hydrolyse
• RFC: clamp : clamp gaan laden. Katalyseert en plaatsen van sliding clamp. Dit is het geel complex.
6
Kirsten Van Gils (2022)
,action of helicases and single-stranded DNA-binding proteins
• Andere eiwitten ontwinden matrijs DNA en stabiliseren enkelstrengige regio’s
• Helicases zijn enzymes die de ontwinding van DNA katalyseren. Gebruik van ATP.
• Single-stranded DNA-binding proteins stabiliseren enkelstrengig DNA Vb.
eukaryotisch ‘replication protein A’ (RPA)
DNA moet uit elkaar gaan. Dit gaat niet zomaar spontaan uit elkaar, DNA polymerase
krijgt dat niet open. Je hebt een eiwit DNA helicase nodig, die het DNA gaat roteren,
ontwinden. Je krijgt enkelstreng DNA dit woeden snel gebonden door single-strand
DNA binding porteins, die vermijden dat de enkelstrengen terug sluiten.
Action of topoisomerases during DNA preplication
• Bij het ontwinden van de strengen van het parentaal DNA moet het DNA
voorafgaand aan de replicatievork roteren: Topoisomerases
Gevolg van ontwinden van DNA is een knoop voor
het DNA. Dit noemen we superwindingen van het
DNA. In dit geval zijn het positieve
superwindingen. Je hebt enzyme nodig die de
positieve superwindingen verwijderen want die
belemmeren andere processen. Topoisomarse
gaat een breuk maken, ze gaan het DNA splitsen.
Hierdoor gaat het DNA ontwinden. Bij circulair
DNA heb je dit zeker nodig, kan niet zomaar
roteren. Bij lineair DNA ook nodig want de
uiteinde zijn beschermd, kan ook niet zomaar
roteren.
• Topoisomerases zijn enzymes die het reversibel breken en koppelen van DNA strengen katalyseren
• Type I: enkelstrengige breuk
• Type II: dubbelstrengige breuk
o DNA replicatie
o Condensatie van mitotische chromosomen
o Scheiding van dochterchromatiden bij meiose
o Veelvuldig gebruikt als targer voor molecule die in staat zijn om de cel te doden. Maken
dubbelstreng breuk en roteren DNA door een lus.
o Inhibitor etoposide: behandeling van kankers: Inhibitoren voor het sluiten van dat proces. Kankers
gaan snel repliceren maar gaan door inhibitor breuken krijgen en gaan dan dood.
o Verschillende antibiotica (ciprofloxacine) hebben als doelwit topoisomerase. DNA wordt geknipt op
verschillende plaatsen. Zeer sterk antibiotica dat in staat is om cellen te doden.
7
Kirsten Van Gils (2022)
,Model of the E.coli replication fork
• De enzymes betrokken bij DNA replicatie zijn werkzaam op een gecoördineerde manier om leidende en
vertraagde strengen bij de replicatievork te synthetiseren: associatie van paren van de replicatieve
polymerases met subeenheden van de clamp-loading eiwitten en helicase
• Belang van Clamp-loading proteins
8
Kirsten Van Gils (2022)
,7.1.3. the fidelity of replication
proofreading by DNA polymerase
• Fouten gedurende replicatie minder dan 1 incorrecte base op 109 nucleotiden (E. coli < 1 fout per 1000
genomen!)
• Op basis van complementariteit (H-brugvorming/verschil in vrije energie): ~1/100 nucleotiden
• DNA polymerase kan correcte nucleotiden selecteren.
• Bij A een T insert in de nieuwe streng. Er is een matching
• Binding van correct NTP induceert een conformatieverandering die leidt tot insertie van correcte base
(‘matching’)
• 1000-voudige verhoging juistheid van incorporatie
• Reduceert foutfrequentie tot 10-5
• Proefleesactiviteit: selectief verwijderen van mismatchen door replicatieve DNA-polymerases.
• polymerase en 3’-5’ exonuclease staan in competitie met elkaar. Normaal wint de polymerase behalve als
de polymerase even niet verder kan (mismatch) dan wint de exonuclease.
• Pol ε en δ; en Pol III
• 3’-5’ exonuclease activiteit
• DNA-polymerases vereisen primers (H-gebonden) en katalyseren de groei van DNA-strengen enkel in de 5
tot 3 richting.
• Indien incorrecte base: waarschijnlijker dat deze verwijderd wordt dan gebruikt als primer
• Correctheid replicatie wordt 100-1000-voudig verhoogd
• Tot 10-7 – 10-8
• 5’-3’ polymerase laat proefleesactiviteit toe (energie via inkomend nucleotide); 3’-5’ polymerase activiteit
laat deze proefleesactiviteit niet toe
• Proofreading: principe van exonuclease, niet complementaire base wordt hiervan afgesplitst
• Bijkomende mechanismen: DNA-herstel
• Verdere reductie tot < 10-9
9
Kirsten Van Gils (2022)
, 7.1.4. origins and the initiation of replication
Origin of replication in E.coli
• Replicatie start bij de oorsprong(en) van replicatie
- Bindingsplaatsen voor eiwitten die replicatie initiëren, deze eiwitten zijn niet DNA polymerase. Kan een
of een complex eiwit zijn. Dit is een initiator eiwit en bereid de oorsprong voor voor DNA polymerase.
Heel de controle van initiatie van DNA replicatie bevindt zich op dit eiwit. Bij eukaryote worden
activiteiten van enzyme vaak gereguleerd door fosfatase.
• Enkelvoudige oorsprong: een enkele, organisme met kleine genomen (paar miljoenen basenparen),
voldoende voor replicatie van bacteriële en virale genomen (SV40).
• Multipele oorsprongen: noodzakelijk voor replicatie van de veel grotere genomen van eukaryote cellen
binnen een redelijke tijdsperiode. Initaite op verschillende plaatsen van het genoom gestart worden.
E.coli regio van 245 basenparen, dit is de ori. Dit is
exact gelokaliseerd, een bepaalde plaats. Hierop
bindt een initiator eiwit, de activiteit is gereguleerd.
Bindt op DNA en destabiliseert het DNA. Er gaan 8-
10 eiwitten op binden om de twee DNA strengen te
scheiden. Ten tweede rekruteert het andere
eiwitten, bijvoorbeeld een helicase, enkelstreng
DNA bindingseiwitten. Op dit moment kan een
primase de primer aanmaken. 2 replicatievorken,
dit is bidirectionele DNA replicatie. De replicatie
eindigt bij de terminator regio. Een deel zijn van
enkelvoudig aanwezig, terwijl deel is ook in 2
kopijen aanwezig. E.coli heeft een haploïde-
diploïde toestand. Genen die betrokken zijn bij eiwit synthese, zijn vaak gelokaliseerd bij de oorsprong van de
replicatie en zijn directioneel gerepliceerd (zelfde richting als DNA replicatie). Dit is bij E.coli, het moet zeer snel
groeien/repliceren. Bij eukaryote is dit niet het geval.
replication origins in eukaryotic chromosomes
• Virussen van dieren zoals SV40: model voor in vitro studie van initiatie van DNA-synthese in eukaryoten.
- Enkelvoudige oorsprong van replicatie (64 bp)
initiatie door viraal T antigen, bindt oorsprong en heeft helicase activiteit
SS DNA-binding protein
DNA pol α/primase complex
• De oorsprongen van replicatie van eukaryote chromosomen zijn eerst bestudeerd in de gist S. cerevisiae. In
de moleculaire biologie gaat men vaak uit naar modelsystemen. De gist is model voor een eenvoudige
eukaryote. Meer complex neemt men het fruitvliegje, …
• E. coli: 30 min voor volledige replicatie (~1000 nucleotiden per seconde; 2 replicatievorken); Men kan hier
al een nieuwe replicatie starten wanneer de vorige nog beter is.
• in dierlijke genomen (~3 x 109 bp per haploïd genoom) indien vanaf 1 ori: 3 weken aan dezelfde snelheid
van E.Coli. Dit is geen optie, de eerste delingen moeten veel sneller gaan. Hiervoor moet men verschillende
oorsprongen zijn van replicatie.
- Door packing is snelheid ongeveer nog 10 X lager
- Replicatie typisch in enkele uren, 1000-den oorsprongen van replicatie
10
Kirsten Van Gils (2022)
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller kirstenvangils. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $8.62. You're not tied to anything after your purchase.
