Summary
Samenvatting - Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (B-KUL-E0F94A)
- Course
- Institution
Samenvatting van hoofdstuk microscopie van het vak methoden.
[Show more]
Seller
Follow
lienconvents
Content preview
Hoofdstuk 5: Microscopie5.1 Fluorescentiemicroscopie
= gebaseerd op de absorptie van licht bij een bepaalde golflengte & emissie van licht met een langere
golflengte
- Specifieke moleculen visualiseren door autofluorescentie of door specifieke fluoroforen of
fluorescente proteines te koppelen aan deze moleculen (Alexa, Green Fluorescent Protein)
Fluorescente moleculen licht met bepaalde golflengte
absorberen => van grond- naar aangeslagen toestand =>
klein deel van energie verliezen & terugvallen nr
grondtoestand waarbij er licht wordt uitgestuurd
Niet elk licht kan dit fluorescent moleculen gaan exciteren => moet bepaalde golflengte hebben
- Excitatiespectrum = hoogte curve komt overeen met licht
die met die specifieke golflengte fluorescente moleculen
gaat exciteren
- Emissiespectrum = hoogte curve komt overeen met
waarschijnlijkheid dat licht met bepaalde golflengte wordt
uitgestuurd
We kunnen spelen met 2 bundels:
- Specifieke golflengte gebruiken zodanig dat we bepaald moleculen gaan exciteren, andere
moleculen niet => specifiek signaal
- Verschillende golflengtes gebruiken zodat we verschillende moleculen gaan exciteren =>
daarna gaan filteren => zo bepaalde golflengte eruit halen
Intenser laserlicht => beter signaal, maar rekening houden met effecten:
- Bleaching: na herhaaldelijke blootstelling aan excitatielicht => fluorescente moleculen gaan
fluorescente eigenschap verliezen
5.1.1 Epi-fluorescentie
Verschil met lichtmicroscopie = hier hebben we 2 bundels
- Excitatielicht waarmee we de fluorescente moleculen gaan exciteren
- Emissielicht
Componenten:
- Excitatiefilter
- Emissiefilter
- Kleur selectieve filter
- Gecombineerd in 1 onderdeel = filter cube
- Onderdelen optimaal op elkaar afstellen zo
1
,Werking:
- Lichtbron (polychromatisch = verschillende golflengtes => grotere flexibiliteit)
- Specifieke golflengte selecteren door excitatiefilter bv. enkel blauwe licht doorlaten
- Stel monochromatisch (bv. laser): geen filter meer nodig, maar flexibiliteit eerder
beperkt
- Blauwe licht gaat invallen op kleur selectieve spiegel = spiegel die enkel licht met bepaalde
golflengte gaat weerspiegelen & andere doorlaten => dit blauwe licht weerspiegelen
- Op specimen terecht komen => fluorescente moleculen exciteren
- Fluorescent signaal uitsturen met langere golflengte & lagere energie
- Terug door kleur selectieve spiegel => nu niet gespiegeld, maar doorgelaten
- Door emissiefilter om kleur tegen te houden of strooilicht tegen te houden
Voordeel:
- Zorgt voor goed contrast
Nadeel:
- Zorgen dat er fluorescente moleculen aanwezig zijn die specifieke informatie bevat
- Microscoop scherp gesteld op focale vlak => enkel contrast in focale vlak zodanig dat
specimen goed in beeld is MAAR volledige specimen hier overspoelen met excitatielicht =>
dus overal waar blauw licht geraakt, gaan moleculen worden geëxciteerd (boven en onder
het focale vlak)
- Achtergrondfluorescentie
- Beperkte scherptediepte
- Zeer beperkte 3D-informatie
<> Optical Sectioning:
- Relatief eenvoudig monstervoorbereiding
- Geen schade aan het monster => meerdere tijdspunten (dynamische processen of beweging)
<> Coupes maken
- Technisch moeilijker uit te voeren en tijdsrovend
- Hoogste resolutie en sensitiviteit
5.1.2 Confocale microscopie
2 pinholes in het focale vlak:
- Pinhole voor lichtbron: ervoor zorgen dat we zeer klein deel van specimen gaan belichten,
focussen op specifiek punt op specimen
- Pinhole voor detector: enkel maar een klein deel van het specimen in beeld gaan brengen
- Stel dat fluorescent licht zich boven of onder het focale vlak bevinden => fluorescent licht
doorheen de pinhole wordt tegengehouden
Nadeel:
- Punt voor punt staal opmeten = tijdsrovend
Voordeel:
2
, - Zorgt wel voor betere resolutie/scherper beeld door secundaire fluorescentie buiten dit punt
in het focale vlak te verwijderen => betere optische doorsnede
Laser Scanning Confocale Microscopie (LSCM)
- Laser
- AOTF = kan pinhole zijn, kan ook lenzensysteem zijn
- 2 spiegels die kunnen bewegen => zo wordt excitatielicht altijd op
andere plaats van het staal geprojecteerd
- Door invalshoek van bundel op onze objectief lens te laten variëren
=> ander punt van specimen belichten
- Zo in 2D onze belichtingsbundel over staal gaan
- Eenmaal focale vlak is gescand => optische doorsnede
- Opnieuw een andere optische doorsnede in beeld brengen => hoogte van staal
veranderen dus focale vlak komt nu overeen met andere optische doorsnede
=> doorsnedes samenvoegen & zo 2D vormen
Gebruik van een PMT detector:
= detector waarbij fotonen worden omgezet naar e- via kathode en anode
- Aan kathode gaan fotonen invallen
- Gaan beperkt aantal e- losslaan door energie die ze afgeven
- e- aangetrokken door dynodes
- Botsing met dynodes
- Zo meer en meer e- losslaan
- Op het einde zeer sterk signaal meten
Voordeel:
- Ideale techniek voor optische doorsnede
Nadeel:
- geen efficiënt gebruik van licht (minder gevoelig dan epi)
- Raster techniek => tijdrovend
- hoog energetisch laserlicht en lange exposure tijden
=> kans op lichtbeschadiging en bleaching
=> niet geschikt voor levende cellen
- slechts enkele excitatie golflengtes owv gebruik van lasers - hoge kost toestel + beperkte
levensduur laser
Spinning Disk Confocale Microscopie
= roterende schijf met verschillende pinholes om tegelijkertijd verschillende punten van het
specimen in beeld te brengen
Principe:
- gebasseerd op nipkow disk => sequentie van 1D signalen
- Excitatielicht verspreiden over pinholes => langs bepaalde lijn doorheen specimen sturen =>
via lenzen op specimen
- Fluorescent licht volgt hetzelfde pad als excitatielicht & gaat opnieuw door pinhole => zo
signaal beperken tot focale vlak => verder geleidt naar de detector
- Verbeterde transmissie van excitatielicht door tweede schijf met microlenzen
3
, Eigenschappen (helderheid, contrast en kwaliteit) van optische doorsnede bepaald door configuratie
pinholes:
- ong 4% licht doorgelaten (laser nodig) bij standaard configuratie ( D = 25-50 μm <> S = 250
μm)
- Meer pinholes dichter bij elkaar => meer licht transmissie
<> out of focus licht door naburige pinholes (meer bij dikkere specimens)
Nadeel:
- Pinholes dichter plaatsen => sensitiever werken => meer risico op autofocus door de
naburige pinholes
- Op focale vlak werken, boven en onder wordt tegengehouden
- Verder van focale vlak => openingshoek veel ruimer => licht kan ontsnappen door naburige
pinholes
- Dus als pinholes dichter bij elkaar staan => sneller lekkage van F licht boven en onder focale
vlak
- Korte sluitingstijd & laat toerental => strepen artefacten, sluitingstijd veel te kort dat deel van
specimen niet wordt opgemeten
- Grote sluitingstijd & dezelfde toerental => streep artefacten verdwijnen
- Grote sluitingstijd & hoog toerental => spinning disk sneller draaien dus ook meer opnames
maken => artefacten ook verdwijnen
Voordeel:
- Bij spinning disk: achtergrondF, iets minder qua kwaliteit laser scanning, maar wel betere
kwaliteit tov breedveld; bij breedveld toch veel achtergrondlicht; bij confocale krijg je zeer
sterk optische doorsnede
- Relatieve sensiteit
o Efficiënter gebruik van licht
o zachtere en snellere techniek (minder toxiciteit en bleaching) <> LSCM
o levende cellen en dynamische processen over langere tijdsintervallen
<> Mindere resolutie (minder goede optische doorsnede) tov LSCM
4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller lienconvents. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.07. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
79373 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now