Deze samenvatting van het vak real-time PCR (qPCR) bestaat uit 17 pagina's. De samenvatting is gemaakt op basis van de colleges en de PowerPoints die tijdens de lessen werden besproken. In de samenvatting wordt zowel de gewone PCR als de real-time PCR besproken. Ook worden RNA/ DNA analyse methodes...
Samenvatting qPCR
RNA isolatie
RNA kan geïsoleerd worden d.m.v. Tripure. Dit bevat fenol en Guanidine Thiocyanate (een
chaotropisch zout). Fenol zorgt voor de scheiding van stoffen in de organische fase, aquatische fase
en de interfase. RNA en DNA bevinden zicht bij een pH van 7-8 in de waterige fase. Bij de isolatie van
RNA moet er altijd met RNase vrije materialen gewerkt worden. Anders kan er gegarandeerd worden
dat het RNA wat je geïsoleerd hebt, afgebroken is. Het is daarom van belang dat je altijd met
handschoenen werkt, alleen wegwerp spullen gebruikt, RNase vrije oplossing gebruikt (DEPC,
guanidine isothyocyanaat, β-mercaptoethanol), epjes en samples alleen openen wanneer nodig,
samples altijd op ijs houden, snel werkt en samples niet te vaak opnieuw invriezen.
DNA kwaliteit
Na de isolatie kan het DNA gekwantificeerd worden. Dit kan gedaan worden door het meten van de
absorptie van uv-licht (bv. nanodrop of Qubit). Bij deze metingen wordt ook de kwaliteit van het DNA
gemeten. Dit wordt uitgedrukt in het A260/A280 ratio. Deze waarde moet tussen de 1,8 en 2,0 zijn.
Lager dan deze waarde duidt op eiwit contaminatie. Dit kan de efficiëntie van de qPCR beïnvloeden.
Ook kan er op deze manier gekeken worden of er contaminatie van bv. fenol of chaotropische zouten
aanwezig is. Deze stoffen zijn namelijk inhibitors voor enzymatische reacties.
De integriteit van RNA kan bekeken worden op een denaturerende gel of met de Agilent Bioanalyzer.
De Bioanalyzer berekend de kwaliteit van het RNA en drukt het uit in een RIN waarde (RNA Integrity
number).
Lab-on-a-chip (LOAC)
Met de LOAC bioanalyser kan de
integriteit van een DNA of RNA
monster bepaald worden. Ook kan
DNA/ RNA makkelijk gevisualiseerd
worden. Voor de analyse is er zeer
weinig van je sample nodig. Er wordt
gewerkt met een erg kleine en dunne
gel dat erg specifieke resultaten geeft.
Na de analyse krijg je een pieken
patroon, banden patroon en een tabel
te zien. Alle 3 deze manieren bevatten
dezelfde informatie maar geven het op
een andere manier weer.
Bij de analyse van RNA zijn er 2 pieken te zien, een bij 18s en een bij 28s rRNA en het achtergrond
signaal is laag. Dit is het resultaat bij ideale omstandigheden en als deze resultaten verkregen
worden betekend dat dat het RNA intact is. Intact RNA heeft een piek bij 28s rRNA dat 2x zoveel RNA
,bevat als dat van het 18s rRNA. Als er spraken is van RNA degradatie, is het achtergrond signaal
hoger. In plaats van dat de achtergrond erg laag is zullen er tussen de 18s en 28s rRNA pieken door
nog kleine pieken te zien zijn. Als er spraken is van afbraak zullen de 18s en 28s pieken kleiner zijn
dan bij intact RNA. Het 28s rRNA zal het snelste afgebroken worden omdat er nou eenmaal 2x zoveel
28s rRNA in het monster zit. Op basis van de hoeveelheid 18s en 28s rRNA berekend de bioanalyser
een RIN-waarde (RNA Integrity Number). Een hoge RIN-waarde verwijst naar goed en intact RNA, een
lage RIN-waarde daarentegen slecht en afgebroken DNA.
End-point PCR
D.m.v. PCR kan een specifieke sequentie van een DNA- of cDNA-template gekopieerd worden
(geamplificeerd). Dit wordt gedaan door sequentie specifieke oligonucleotide, een thermostabiele
DNA polymerase en een hitte cyclus. Bij de traditionele PCR (end-point PCR) wordt de detectie en
kwantificatie na de hele reactie verricht. Hiervoor worden post-PCR analyses voor gebruikt zoals,
gelelektroforese. De analyse wordt dus pas uitgevoerd wanneer de plateau-fase van de reactie is
bereikt.
End-point PCR wordt voornamelijk gebruikt om specifiek DNA te amplificeren voor sequencing,
kloneren en andere moleculaire technologieën.
qPCR
Bij real-time quantitative PCR (qPCR) wordt het PCR product bij elke cyclus gemeten. Dit wordt
gedaan door de reacties te controleren tijdens de exponentiële fase van de reactie. Op deze manier
kan de begin concentratie van het target zeer precies bepaald worden. Na elke cycli wordt de
hoeveelheid DNA gemeten door een fluorescerende kleurstof. Deze kleurstof bindt aan DNA en
zodra het aantal PCR producten (amplicons) toeneemt, zal de hoeveelheid fluorescentie ook
toenemen. Fluorescente reporters die gebruikt worden bij qPCR zijn dsDNA-bindende kleurstoffen of
kleurstof moleculen gebonden aan PCR primers of probes die hybridiseren met PCR producten
tijdens de amplificatie. Het meten van de fluorescentie wordt uitgevoerd door een real time PCR
instrument dat de fluorescentie meet terwijl het de thermische cycli uitvoert. Tijdens het runnen van
de PCR kan het DNA dus al aangetoond worden. De lengte van de meeste real-time PCR producten
zijn tussen de 60 en de 200 baseparen (bp). Met behulp van qPCR is het mogelijk om specifieke DNA
sequenties te amplificeren en te detecteren.
Voordelen van qPCR:
- Mogelijkheid om de vooruitgang van PCR in real-time bij te houden.
- Mogelijkheid om de precieze hoeveelheid amplicons bij elke cyclus te meten. En hiermee kan
de hoeveelheid startmateriaal specifiek bepaald worden.
- Een toenemende dynamisch bereik van detectie.
- Amplificatie en detectie vindt plaats in één epje. Hiermee worden post-PCR manipulaties
geëlimineerd.
- Mogelijk om micro-organismen snel op te sporen.
,Kwantificatie PCR is het specifiek of niet-specifiek detecteren van het geamplificeerde product. Dit
kan gebruikt worden bij genexpressie analyse, pathogeen detectie/ kwantificatie en microRNA
kwantificatie.
Kwalitatieve PCR is de aanwezigheid of de afwezigheid van een bepaalde sequentie detecteren. Dit
kan gebruikt worden bij het bepalen van het subtype van een virus of bacterie, SNP’s detecteren en
allelische discriminatie tussen wildtype en mutant.
Bij absolute kwantificatie worden onbekende monsters vergeleken met de standaardcurve zodat de
concentratie bepaald kan worden.
Bij relatieve kwantificatie wordt de expressie van een gen in een monster (behandeld) vergeleken
met het gen in een ander monster (onbehandeld). De resultaten worden uitgedrukt in een factor
verandering in expressie van het behandelde monster ten opzichte van het onbehandelde monster.
Bij deze methode wordt er een normaliserend gen (β-actine) gebruikt als controle.
PCR stappen
1. Denaturatie: in deze stap worden het dsDNA gesmolten (gedenatureerd) naar ssDNA. Bij een
temperatuur van 95 C ͦ verliest het molecuul zijn secundaire structuur doordat de
waterstofbruggen tussen de 2 strengen kapot gaan.
2. Annealing: in deze stap binden de primers aan het ssDNA. Er moet een gepaste temperatuur
gebruik worden, anders zullen de primers niet hybridiseren (te lage temperatuur) of ze zullen
juist smelten (te hoge temperatuur). De smelttemperatuur wordt berekend en hier wordt 5
C
ͦ onder gezeten.
3. Extention: dit gebeurd bij een temperatuur van 70-72 ͦC. Op deze temperatuur is de activiteit
van DNA polymerase optimaal. De primer extention vindt plaats met een snelheid van 100
basen per seconden.
Meestal worden er ongeveer 40 cycli gerund tijdens een PCR. Een goed lopende reactie hangt af van
verschillende factoren:
- DNA polymerase: meestal wordt taq polymerase gebruikt. Deze polymerase heeft echter nog
activiteit bij lage temperaturen waardoor er aspecifieke- bindingen en gesynthetiseerde
producten uit voort kunnen komen. Om dit te voorkomen kan er een ‘’hot-start’’ enzym
gebruikt worden.
- Genoeg en goede dNTPs.
- Magnesium concentratie: tussen 3-6 mM, meestal 3 mM MgCl.
- Template DNA: tussen 100 pg en 1 µg genomisch DNA of cDNA van 1 pg tot 100 ng RNA.
RT-qPCR
Kwantitatieve reverse transcriptase PCR is een kwantitatieve PCR methode. Bij deze methode is een
RNA template nodig en een reverse transcriptase enzym. Complementair aan het RNA template
wordt cDNA gemaakt. Deze methode wordt gebruikt om de expressie van een bepaald gen te
onderzoeken. De nauwkeurigheid van deze methode hangt af van de kwaliteit en kwantiteit van het
RNA en cDNA.
, Om cDNA te kunnen maken van RNA moeten eerst de secundaire structuren van het RNA
gedenatureerd worden. Dit gebeurd aan het begin van de reactie bij 65 Cͦ . Als het RNA
gedenatureerd is, kunnen de primers gaan hechten. Als de primers aan het template gehecht zijn kan
de reverse transcriptase starten met zijn werk en een cDNA streng synthetiseren.
De RT-PCR kan uitgevoerd worden in 2 stappen of in 1. Bij de 2-staps reactie wordt er gestart met
een reverse transcriptie van RNA of poly(A) RNA naar cDNA. Hiervoor wordt het enzym reverse
transcriptase (RT) gebruikt. Aan het einde van de reactie zal er ongeveer 10% van het cDNA
overgebracht worden in een ander epje en gebruikt worden voor de real-time PCR reactie. Beide
reacties worden hierbij uitgevoerd in een geoptimaliseerde buffer van het enzym.
Voordelen van deze techniek zijn:
- cDNA kan gewaard worden en gebruikt worden voor andere reacties.
- Hogere sensitiviteit omdat de 2 reacties verlopen bij hun individuele geoptimaliseerde
buffers.
- Er kunnen verschillende targets verkregen worden uit 1 enkel RNA sample.
Nadelen:
- RT enzymen en buffers kunnen de qPCR remmen.
- Minder gemakkelijk, het vereist meerdere handelingen.
- Risico op contaminatie omdat er gewerkt wordt met verschillende epjes.
Bij de 1-staps qRT-PCR worden de cDNA reactie en de real-time reactie in hetzelfde epje uitgevoerd.
Hiermee wordt de mogelijkheid op contaminatie verminderd. Voor deze methode zijn GSP’s
verplicht. Oligo(dT) en random primers zullen aspecifieke producten vormen waardoor de
concentratie van het product van interesse zal verminderen.
Voordelen:
- Voorkomen van contaminatie omdat er in een gesloten epjes systeem gewerkt wordt.
- Het is gemakkelijk omdat er minder pipetteer handelingen etc. verricht hoeven worden.
- High-throughout sample screening.
- Sensitiviteit, al het cDNA dat gemaakt is, is ter beschikking voor de qPCR.
Nadelen:
- Groter risico op primer dimers die gevormd worden bij de temperatuur omstandigheden van
de RT (deze lijken op die van de annealing).
- cDNA is niet beschikbaar voor andere qPCR reacties.
Real-time PCR kan voor verschillende assays gebruikt worden:
1. Gen expressie profilering: het relatieve overvloed aan transcripten wordt beoordeeld zodat
er gen expressie patronen gemaakt kunnen worden tussen samples.
2. Virale titerbepaling: het kwantificeren van het aantal virale amplificaties in een sample. Dit
wordt vaak gedaan door de resultaten te vergelijken met een standaardcurve.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller pienkuijken. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.59. You're not tied to anything after your purchase.
