Moleculaire en biochemische technieken 05/09/24
cDNA is DNA zonder intronen. Van mRNA naar DNA: reverse transcriptase
PCR mastermix: DNA template, PCR primers fw en rv, DNA polymerase, dNTP’s, PCR reactie buffer en
MgCl2.
PCR reactiebuffer, stabiliseert de pH. MgCl2 magnesium ionen zijn een cofactor voor DNA polymerase.
Denaturatie: DNA splitsen in twee enkele strengen. Hoge temperatuur 98°C.
Annealing: primers hechten aan DNA streng. Meestal tussen de 50°C en 60°C graden, afhankelijk van
primers.
Elongatie: Taq polymerase zet dNTP’s aan primer. 72°C afhankelijk van de DNA polymerase soort.
Taq DNA polymerase, hoge kwaliteit geen proofreading
Pfu DNA polymerase, wel proofreading
Phusion High Fidelity DNA polymerase, hogere kwaliteit dan Pfu maar erg duur
Forward primer heeft een elongatie naar rechts, reverse primer heeft een elongatie naar links. Onderste
streng is altijd complementair aan de bovenste streng. Primers zijn complementair aan de streng waar
deze aan moet binden.
Primer is tussen de 18 en 24 bp lang, CG content is 50%-60%, 3’ end moet een C of G zijn, niet
complementair binnen de sequentie, niet complementair aan zichzelf of aan elkaar (min. 3bp), afstand
niet langer dan 1-2 kb lang en Ta geen groter verschil dan 5°C.
Achter het start-codon (ATG) en voor het stop-codon (TGA,TAA,TAG).
Taq 60 seconden per 1000 nucleotides.
MOLECULAIRE EN BIOCHEMISCHE TECHNIEKEN 16/09/24
Lacl gen codeert voor het lac repressor eiwit.
AmpR codeert voor beta-lactamase (ampicilline resistentie).
GST codeert voor glutathione S tranferase.
In de pGEX-4T-1 vector is de tac promotor voor de IDH1 sequentie die m.b.v. de MCS (multiple cloning
site) in de vector is geplaatst. Deze vector gevat in de MCS een stopcodon. De ampicilline resistentie is
belangrijk zodat de bacterie de vector niet uit de cel gooit. Tijdens het kloneren van de IDH1 sequentie
wordt het GST eiwit meegenomen, zo wordt dit het GST-IDH1 eiwit. GST wordt gebruikt voor de zuivering
van het eiwit. Deze vector bevat tevens het lac operon.
De pET-15b vector bevat de T7 promotor, het lac operon en een ampicilline resistentie. Deze vector heeft
geen GST, maar 6x HIS. Hierdoor wordt het IDH1 eiwit het his-IDH1 eiwit. 6x his wordt gebruikt om het
eiwit te kunnen isoleren. Deze heeft geen stopcodon maar een T7 terminator.
De pBAD/His vector bevat de pBAD promotor, het araC operon, en een ampicilline resistentie. Deze
vector heeft geen GST, maar 6x HIS. Hierdoor wordt het IDH1 eiwit het his-IDH1 eiwit. 6x his wordt
gebruikt om het eiwit te kunnen isoleren. Deze heeft geen stopcodon maar een pBAD terminator.
Pagina 10 van 17
cDNA is DNA zonder intronen. Van mRNA naar DNA: reverse transcriptase
PCR mastermix: DNA template, PCR primers fw en rv, DNA polymerase, dNTP’s, PCR reactie buffer en
MgCl2.
PCR reactiebuffer, stabiliseert de pH. MgCl2 magnesium ionen zijn een cofactor voor DNA polymerase.
Denaturatie: DNA splitsen in twee enkele strengen. Hoge temperatuur 98°C.
Annealing: primers hechten aan DNA streng. Meestal tussen de 50°C en 60°C graden, afhankelijk van
primers.
Elongatie: Taq polymerase zet dNTP’s aan primer. 72°C afhankelijk van de DNA polymerase soort.
Taq DNA polymerase, hoge kwaliteit geen proofreading
Pfu DNA polymerase, wel proofreading
Phusion High Fidelity DNA polymerase, hogere kwaliteit dan Pfu maar erg duur
Forward primer heeft een elongatie naar rechts, reverse primer heeft een elongatie naar links. Onderste
streng is altijd complementair aan de bovenste streng. Primers zijn complementair aan de streng waar
deze aan moet binden.
Primer is tussen de 18 en 24 bp lang, CG content is 50%-60%, 3’ end moet een C of G zijn, niet
complementair binnen de sequentie, niet complementair aan zichzelf of aan elkaar (min. 3bp), afstand
niet langer dan 1-2 kb lang en Ta geen groter verschil dan 5°C.
Achter het start-codon (ATG) en voor het stop-codon (TGA,TAA,TAG).
Taq 60 seconden per 1000 nucleotides.
MOLECULAIRE EN BIOCHEMISCHE TECHNIEKEN 16/09/24
Lacl gen codeert voor het lac repressor eiwit.
AmpR codeert voor beta-lactamase (ampicilline resistentie).
GST codeert voor glutathione S tranferase.
In de pGEX-4T-1 vector is de tac promotor voor de IDH1 sequentie die m.b.v. de MCS (multiple cloning
site) in de vector is geplaatst. Deze vector gevat in de MCS een stopcodon. De ampicilline resistentie is
belangrijk zodat de bacterie de vector niet uit de cel gooit. Tijdens het kloneren van de IDH1 sequentie
wordt het GST eiwit meegenomen, zo wordt dit het GST-IDH1 eiwit. GST wordt gebruikt voor de zuivering
van het eiwit. Deze vector bevat tevens het lac operon.
De pET-15b vector bevat de T7 promotor, het lac operon en een ampicilline resistentie. Deze vector heeft
geen GST, maar 6x HIS. Hierdoor wordt het IDH1 eiwit het his-IDH1 eiwit. 6x his wordt gebruikt om het
eiwit te kunnen isoleren. Deze heeft geen stopcodon maar een T7 terminator.
De pBAD/His vector bevat de pBAD promotor, het araC operon, en een ampicilline resistentie. Deze
vector heeft geen GST, maar 6x HIS. Hierdoor wordt het IDH1 eiwit het his-IDH1 eiwit. 6x his wordt
gebruikt om het eiwit te kunnen isoleren. Deze heeft geen stopcodon maar een pBAD terminator.
Pagina 10 van 17
