Cellulaire
toxicologie:
Practicum
genexpressie
,CELLULAIRE TOXICOLOGIE: ................................................................................................................................................. 1
PRACTICUM GENEXPRESSIE ............................................................................................................................................... 1
H1: INLEIDING: TRANSCRIPTOMICS.................................................................................................................................... 1
1.1 TRANSCRIPTOMICS? ....................................................................................................................................................... 1
1.1.1 Soorten RNA ..................................................................................................................................................... 1
1.1.2 Doel van transcriptomics................................................................................................................................... 1
1.1.3 Verschillende methodes .................................................................................................................................... 2
1.2 REAL-TIME PCR (QPCR) ................................................................................................................................................ 4
1.2.1 RNA extractie .................................................................................................................................................... 5
1.2.2 Verwijderen van genomisch DNA ...................................................................................................................... 6
1.2.3 cDNA-synthese .................................................................................................................................................. 6
1.2.4 qPCR ................................................................................................................................................................. 7
H2: PRIMER DESIGN ......................................................................................................................................................... 10
Lengte van het amplicon.......................................................................................................................................... 10
Lengte van de primers ............................................................................................................................................. 10
Smelttemperatuur van de primers ........................................................................................................................... 10
Zelfcomplimentariteit van de primers ...................................................................................................................... 11
Locatie in het gen waar de primers gaan binden ...................................................................................................... 11
EFFECTIEF PRIMER DESIGN, WAAROP LETTEN BIJ ONLINE TOOLS .................................................................................................... 11
H3: PRIMER EFFICIËNTIE .................................................................................................................................................. 12
Bepalen primerefficiëntie ......................................................................................................................................... 12
Factoren die een invloed hebben op de primerefficiëntie.......................................................................................... 12
Efficiëntie beoordelen .............................................................................................................................................. 13
PRAKTIJK PRIMER EFFICIËNTIE ......................................................................................................................................... 14
SOD1 ............................................................................................................................................................................ 14
P53 .............................................................................................................................................................................. 15
HMBS ........................................................................................................................................................................... 15
H4: DATA-ANALYSE QPCR ................................................................................................................................................. 16
4.1 NORMALISEREN .......................................................................................................................................................... 16
Waarom moeten we data normaliseren? ................................................................................................................. 16
Hoe data normaliseren? .......................................................................................................................................... 16
Referentiegenen vs household genen? ..................................................................................................................... 17
4.2 OUTLINE: UNIFORMITEIT ............................................................................................................................................... 18
4.2.1 MIQE richtlijnen .............................................................................................................................................. 18
4.2.2 Selectie referentiegenen voor RT-qPCR ............................................................................................................ 18
4.2.3 Onzekerheden rapporteren en minimaliseren in nauwkeurigheid van gegevens .............................................. 19
PRAKTIJK DATA-ANALYSE.................................................................................................................................................. 23
H5: HALFWAARDETIJD ..................................................................................................................................................... 29
5.1 THEORIE.................................................................................................................................................................... 29
Halfwaardetijd ........................................................................................................................................................ 29
Compartimentmodellen ........................................................................................................................................... 29
Zaken die invloed hebben op de halfwaardetijd ....................................................................................................... 30
Formules en praktische zaken .................................................................................................................................. 30
5.2 OEFENINGEN.............................................................................................................................................................. 31
,H1: Inleiding: transcriptomics
1.1 Transcriptomics?
Transcriptomics = vakgebied binnen moleculaire biologie dat zich richt op de studie van
RNA-transcripten die worden geproduceerd door genoom v/e cel/organisme
→ analyse v/d complete set RNA-transcripten aanwezig in specifieke cel/weefsel of bepaald
moment; ook wel het transcriptoom genoemd
Transcriptoom = vertegenwoordigt het volledige repertoire van RNA-moleculen
→ messenger RNA (mRNA), niet-coderend RNA (ncRNA),…
→ elk type RNA-molecuul vervult verschillende functies binnen de cel
1.1.1 Soorten RNA
• Messenger RNA (mRNA)
o functie: verantwoordelijk voor overbrengen genetische info v/h DNA naar de ribosomen,
waar het wordt vertaald naar eiwitten (translatie); dient als tijdelijke kopie van
DNA die de genetische code draagt
o belang: mRNA-niveaus geven indicatie welke genen actief zijn en worden vertaald nr
eiwitten op een bep moment. Door dit te kwantificeren, kunnen we inzicht
krijgen in welke genen uitgedrukt worden op welk niveau
• Ribosomaal RNA (rRNA)
o functie: belangrijk onderdeel van ribosomen (hier eiwitten synthese); vormt structuur
waarop mRNA en tRNA binden tijdens eiwitsyntheseprocessen
o belang: aanwezigheid en activiteit rRNA kan aangeven hoe actief het is in eiwitsynthese
• Transfer RNA (tRNA)
o functie: transporteert AZ naar ribosomen tijdens eiwitsynthese, bevat anticodon
complementair aan mRNA voor juiste toevoeging AZ aan groeiende eiwitketen
o belang: beschikbaarheid en activiteit tRNA beïnvloeden rechtstreeks de snelheid en
efficiëntie van eiwitsynthese
• Niet-coderend RNA (ncRNA)
o functie: breed scala moleculen die geen code dragen voor eiwitten; bel in regulatie-
processen, zoals genexpressie, transcriptieverwerking, epigenetische regulatie
o belang: fungeren als regulators voor genexpressie op verschillende niveaus
1.1.2 Doel van transcriptomics
Bij transcriptomics gaan we dus genexpressie meten op niveau van RNA met als doel om de
genexpressie niveaus te vergelijken tussen:
• verschillende celtypes/weefsels binnen eenzelfde organisme
• gezonde en zieke cellen/organismen
• cellen/organismen al dan niet blootgesteld aan stressfactor
1
, 1.1.3 Verschillende methodes
Er zijn verschillende methodes om aan transcriptomics te doen
→ focus van ons ligt vooral op real-time PCR (qPCR), maar we bespreken ook kort volgende:
Northern Blot
wat klassieke methode om specifieke RNA-moleculen in een sample te detecteren en
te kwantificeren. Maakt gebruik van een gelelektroforese om RNA-moleculen te
scheiden obv grootte en vervolgens worden de gescheiden moleculen
overgebracht naar een membraan waar ze worden gedetecteerd mbv een probe
hoe RNA-moleculen worden gescheiden op een gel obv hun grootte. Vervolgens
worden de gescheiden RNA-moleculen overgebracht naar een nylon membraan
(blotten). Een RNA-specifieke probe, meestal een complementair oligonucleotide
en radioactief, wordt toegevoegd aan het membraan en bindt specifiek aan het
RNA van interesse. Door de probe te detecteren, kan de aanwezigheid en
hoeveelheid van het specifieke RNA worden vastgesteld.
voordelen Relatief eenvoudige techniek, geschikt voor kwantificeren van specifieke RNA’s
nadelen Minder gevoelig (zeker voor kleine verschillen op te sporen), redelijk traag en dus
moeilijk te gebruiken bij detectie lage-abundante RNA-soorten
2
toxicologie:
Practicum
genexpressie
,CELLULAIRE TOXICOLOGIE: ................................................................................................................................................. 1
PRACTICUM GENEXPRESSIE ............................................................................................................................................... 1
H1: INLEIDING: TRANSCRIPTOMICS.................................................................................................................................... 1
1.1 TRANSCRIPTOMICS? ....................................................................................................................................................... 1
1.1.1 Soorten RNA ..................................................................................................................................................... 1
1.1.2 Doel van transcriptomics................................................................................................................................... 1
1.1.3 Verschillende methodes .................................................................................................................................... 2
1.2 REAL-TIME PCR (QPCR) ................................................................................................................................................ 4
1.2.1 RNA extractie .................................................................................................................................................... 5
1.2.2 Verwijderen van genomisch DNA ...................................................................................................................... 6
1.2.3 cDNA-synthese .................................................................................................................................................. 6
1.2.4 qPCR ................................................................................................................................................................. 7
H2: PRIMER DESIGN ......................................................................................................................................................... 10
Lengte van het amplicon.......................................................................................................................................... 10
Lengte van de primers ............................................................................................................................................. 10
Smelttemperatuur van de primers ........................................................................................................................... 10
Zelfcomplimentariteit van de primers ...................................................................................................................... 11
Locatie in het gen waar de primers gaan binden ...................................................................................................... 11
EFFECTIEF PRIMER DESIGN, WAAROP LETTEN BIJ ONLINE TOOLS .................................................................................................... 11
H3: PRIMER EFFICIËNTIE .................................................................................................................................................. 12
Bepalen primerefficiëntie ......................................................................................................................................... 12
Factoren die een invloed hebben op de primerefficiëntie.......................................................................................... 12
Efficiëntie beoordelen .............................................................................................................................................. 13
PRAKTIJK PRIMER EFFICIËNTIE ......................................................................................................................................... 14
SOD1 ............................................................................................................................................................................ 14
P53 .............................................................................................................................................................................. 15
HMBS ........................................................................................................................................................................... 15
H4: DATA-ANALYSE QPCR ................................................................................................................................................. 16
4.1 NORMALISEREN .......................................................................................................................................................... 16
Waarom moeten we data normaliseren? ................................................................................................................. 16
Hoe data normaliseren? .......................................................................................................................................... 16
Referentiegenen vs household genen? ..................................................................................................................... 17
4.2 OUTLINE: UNIFORMITEIT ............................................................................................................................................... 18
4.2.1 MIQE richtlijnen .............................................................................................................................................. 18
4.2.2 Selectie referentiegenen voor RT-qPCR ............................................................................................................ 18
4.2.3 Onzekerheden rapporteren en minimaliseren in nauwkeurigheid van gegevens .............................................. 19
PRAKTIJK DATA-ANALYSE.................................................................................................................................................. 23
H5: HALFWAARDETIJD ..................................................................................................................................................... 29
5.1 THEORIE.................................................................................................................................................................... 29
Halfwaardetijd ........................................................................................................................................................ 29
Compartimentmodellen ........................................................................................................................................... 29
Zaken die invloed hebben op de halfwaardetijd ....................................................................................................... 30
Formules en praktische zaken .................................................................................................................................. 30
5.2 OEFENINGEN.............................................................................................................................................................. 31
,H1: Inleiding: transcriptomics
1.1 Transcriptomics?
Transcriptomics = vakgebied binnen moleculaire biologie dat zich richt op de studie van
RNA-transcripten die worden geproduceerd door genoom v/e cel/organisme
→ analyse v/d complete set RNA-transcripten aanwezig in specifieke cel/weefsel of bepaald
moment; ook wel het transcriptoom genoemd
Transcriptoom = vertegenwoordigt het volledige repertoire van RNA-moleculen
→ messenger RNA (mRNA), niet-coderend RNA (ncRNA),…
→ elk type RNA-molecuul vervult verschillende functies binnen de cel
1.1.1 Soorten RNA
• Messenger RNA (mRNA)
o functie: verantwoordelijk voor overbrengen genetische info v/h DNA naar de ribosomen,
waar het wordt vertaald naar eiwitten (translatie); dient als tijdelijke kopie van
DNA die de genetische code draagt
o belang: mRNA-niveaus geven indicatie welke genen actief zijn en worden vertaald nr
eiwitten op een bep moment. Door dit te kwantificeren, kunnen we inzicht
krijgen in welke genen uitgedrukt worden op welk niveau
• Ribosomaal RNA (rRNA)
o functie: belangrijk onderdeel van ribosomen (hier eiwitten synthese); vormt structuur
waarop mRNA en tRNA binden tijdens eiwitsyntheseprocessen
o belang: aanwezigheid en activiteit rRNA kan aangeven hoe actief het is in eiwitsynthese
• Transfer RNA (tRNA)
o functie: transporteert AZ naar ribosomen tijdens eiwitsynthese, bevat anticodon
complementair aan mRNA voor juiste toevoeging AZ aan groeiende eiwitketen
o belang: beschikbaarheid en activiteit tRNA beïnvloeden rechtstreeks de snelheid en
efficiëntie van eiwitsynthese
• Niet-coderend RNA (ncRNA)
o functie: breed scala moleculen die geen code dragen voor eiwitten; bel in regulatie-
processen, zoals genexpressie, transcriptieverwerking, epigenetische regulatie
o belang: fungeren als regulators voor genexpressie op verschillende niveaus
1.1.2 Doel van transcriptomics
Bij transcriptomics gaan we dus genexpressie meten op niveau van RNA met als doel om de
genexpressie niveaus te vergelijken tussen:
• verschillende celtypes/weefsels binnen eenzelfde organisme
• gezonde en zieke cellen/organismen
• cellen/organismen al dan niet blootgesteld aan stressfactor
1
, 1.1.3 Verschillende methodes
Er zijn verschillende methodes om aan transcriptomics te doen
→ focus van ons ligt vooral op real-time PCR (qPCR), maar we bespreken ook kort volgende:
Northern Blot
wat klassieke methode om specifieke RNA-moleculen in een sample te detecteren en
te kwantificeren. Maakt gebruik van een gelelektroforese om RNA-moleculen te
scheiden obv grootte en vervolgens worden de gescheiden moleculen
overgebracht naar een membraan waar ze worden gedetecteerd mbv een probe
hoe RNA-moleculen worden gescheiden op een gel obv hun grootte. Vervolgens
worden de gescheiden RNA-moleculen overgebracht naar een nylon membraan
(blotten). Een RNA-specifieke probe, meestal een complementair oligonucleotide
en radioactief, wordt toegevoegd aan het membraan en bindt specifiek aan het
RNA van interesse. Door de probe te detecteren, kan de aanwezigheid en
hoeveelheid van het specifieke RNA worden vastgesteld.
voordelen Relatief eenvoudige techniek, geschikt voor kwantificeren van specifieke RNA’s
nadelen Minder gevoelig (zeker voor kleine verschillen op te sporen), redelijk traag en dus
moeilijk te gebruiken bij detectie lage-abundante RNA-soorten
2
