Summary
Samenvatting - Biotechnologie (Life Science)
- Course
- Institution
Samenvatting - Biotechnologie (Life Science) Aan de Hogeschool Utrecht
[Show more]
Seller
Follow
laralommers
Content preview
Leerdoelen biotechnologieLes 1
De belangrijkste deelgebieden van de moderne biotechnologie te benoemen
Medicine and pharmacy
Agriculture and plants
Sea and resources
Industry
Evironment
Waste industry
Uiteen te zetten wat men onder een expressiesysteem verstaat en wat de belangrijkste
componenten er van zijn.
Vectoren: plasmide, virussen, plasmide-virus tussenvormen en artificieel chromosoom
DNA transfer methoden
E. coli: CaCl2 + heatshock, Electroporatie
Animale cellen: CaPO4 precipitatie, Lipofectie, Electroporatie, Retrovirussen
Gist: Protoplast fusie, Electroporatie
Planten cellen: Agrobacterium tumefaciens, Particle bombardment, Gene gun, DNA whisker
(koolstof naaldjes), Plantenvirussen
Transfectie: opname vreemd DNA (tijdelijk), meestal animale cel bedoeld.
Transformatie: opname vreemd DNA (integratie in gastheer genoom, blijvend veranderd), zowel
animaal als prokaryoot.
Infectie: DNA transfer d.m.v. virale vector.
Transductie: DNA overdracht tussen prokaryoten d.m.v. een faag.
Diverse voorbeelden te geven van recombinante eiwittenen hun toepassingen.
Virale kapseleiwitten (vaccins)
Enzymen (stofwisselingsziekten)
Antilichamen
Stollingsfactoren (Hemofilie)
Hormonen en groeifactoren (insuline, EPO, groeihormoon)
Immuunregulatie (TNFα, interleukines, interferonen
Landbouwgewassen (glutenvrij, bestand tegen hitte, rijst met vitamine A)
Schoonmaakmiddelen (proteases, lipases)
Waterzuivering
,De belangrijkste voor-en nadelen te noemen van prokaryote-en eukaryote expressiesystemen.
Voor een bepaalde toepassing een goed onderbouwde afweging kunnen maken in de keuze van
een expressiegastheer
Toepassing eindprodukt: wat wil je er mee?
Hoe nauw komt afwijkende PTM?
Produktieschaal (hoeveel produkt gewenst?)
Gemak van kweken (speciale media/faciliteiten?)
Dure componenten in media?
Veiligheidsmaatregelen?
Speciaal getraind personeel?
Wet- en regelgeving?
Speelt produktiesnelheid een rol?
Geschikte expressievector voorhanden?
Down-stream processing?
Commerciële belangen?
Spelen er ethische kwesties?
Les 2
Te beschrijven wat genomische- en cDNA banken zijn, hoe ze gemaakt worden en wat de
verschillen ertussen zijn.
Genomische banken: Compleet genoom (partieel) fragmenteren met restrictie enzymen of
shearing. Fragmenten ligeren in plasmiden, bacteriofaag λ of BAC. De recombinant plasmiden zet
je in bacteriën. Nadelen: Erg veel fragmenten. Misschien geen aangrenzende restrictie sites?
Misschien knip in het gen?
cDNA banken: mRNA isoleren en vanuit daar een bank maken. Je hebt dan genen die
daadwerkelijk tot expressie komen (weefselspecifiek, moment afhankelijk), zonder introns (post-
splicing), alle splice varianten aanwezig en veel kleinere fragmenten. Nadelen: Moeilijk om het
complete gen te pakken te krijgen (lage processivity reverse transcriptase), RNAse aktiviteit,
mRNA instabiliteit, Hairpins in mRNA.
, Aan dit cDNA kun je linkers (adapters) aan ligeren waar bijvoorbeeld een restrictie site aanzit. Dit
cDNA met linker kun je ligeren in een plasmide en deze transformeren in de E. coli.
Te beschrijven hoe banken gescreend kunnen worden d.m.v. probe hybridisatie en
expressieanalyse.
Kolonie hybridisatie: Je kijkt welk plasmide het gezochte gen bevat. De bank ‘library’ aan
bacterien is uitgeplaat over agar platen, waardoor kolonies zijn gevormd. Alkali wordt gebruikt
om het DNA te denatureren waardoor er ss overblijft. Het DNA wordt aan een filter gebakken bij
80 graden. Probe toevoegen voor herkenning, die specifiek aan het gezochte gen hybridiseren.
Vervolgens kan je de kolonie aanstippen, opkweken en het plasmide isoleren.
Expressieanalyse: Het genomisch- of cDNA wordt in een expressievector ipv een kloneervector
geplaatst. Je gaat screenen op het gezochte eiwit mbv antilichamen. Die kolonie stip je aan en de
vector isoleer je.
Uit te leggen wat de voor-en nadelen zijn van gen isolatiemiddels PCR en DNA synthese.
PCR gen isolatie: je ontwerpt primers die aan het goi zitten om zo het gen te isoleren. Door
primers te nemen met restrictie sites kun je deze ook makkelijk in een plasmide brengen. Taq pol
eindigt altijd met een 3’-A. Ligeren in speciale “T-vector” (lineair met T-overhang, zie afbeelding).
Op deze T-overhang is ook weer heel makkelijk te knippen door verschillende restrictie-enzymen.
Nadelen: Geamplificeerde fragmenten meestal te kort om compleet gen te bevatten. Exonen
afzonderlijk PCR > complexe constructen. PCR procedure induceert vaak mutaties in sequentie.
Voor primer ontwerp moet er sequentie informatie beschikbaar zijn.
, Artificïele gensynthese (synthetic biology): Het synthetisch maken van DNA. Hier kan je nog maar
hele kleine stukjes mee maken (genoeg voor primers). Alle denkbare sequenties (inclusief
‘mutaties’) kunnen gesynthetiseerd worden.
Toepassingen van puntmutaties, inserties en deletieste benoemen
In de witte biotechnologie: Industriële processen verlopen onder hele andere condities dan
fysiologische processen. Er zijn enzymen nodig die bestand zijn tegen hoge temperaturen,
organische oplosmiddelen, hoge/lage pH etc., een hogere katalytische efficiëntie hebben, geen
co-factor meer nodig hebben, resistent zijn tegen proteases, aangepaste regulatie (geen
negatieve feedback door product).
Extra cysteines > extra zwavelbruggen > hogere temperatuurtolerantie.
Wordt de functie van het eiwit hierdoor niet beïnvloedt?
In de rode biotechnologie: Humaan groei hormoon bindt aan twee receptoren: prolactine
receptor en groeihormoon receptor. Een modificatie vermindert de bijwerkingen (prolactine
activatie). Of bijv modificaties om langere circulatietijden te bereiken (minder injecties).
Verschillende technieken te beschrijven waarmee mutaties geïntroduceerd kunnen worden in een
gen.
Via random mutagenesis (PCR met mix van (deels) random primers. Blootstelling organisme aan
mutagene stoffen of straling. Selectie van eiwitten met gewenste eigenschappen en nieuwe
ronden (directed evolution).) of specifieke mutagenesis (Specifieke mutaties aanbrengen in
gen/eiwit d.mv. Moleculaire technieken (recombinatie, PCR, Crispr-Cas).)
Silent: geen effect op aminozuursequentie
Missense: verandert een aminozuur
Nonsense: creëert een stopcodon
Frameshift: kan voor een missense of nonsense zorgen.
Met een restrictie-enzym is een plasmide open te knippen. Dan zou je door nucleases dit korter
kunnen maken of bij bijv een sticky uiteinde kan je deze weer opvullen mbv DNA polymerase.
Oliognucleotide-directed mutagenesis: het target DNA is in een plasmide gebracht. Deze
plasmide maak je enkelstrengs en hierin wordt een Synthetisch ss oligo DNA (inclusief
puntmutatie) geïntroduceerd. Met DNA polymerase wordt het plasmide afgemaakt en dan heb je
een puntmutatie in je goi.
PCR-amplified directed mutagenesis: Mutatie in primer geeft mutatie in PCR product. 50% van
produkten heeft de mutatie.
Gene editing: Direct mutaties aanbrengen in genomen van levende cellen/organismen.
Bekendste voorbeeld is Crispr-Cas9
Diverse toepassingen van fusie-eiwitten te benoemen (o.a. zuivering, reporter, oplosbaarheid,
secretie etc.)
Fusie-eiwit: Twee genen in hetzelfde open leesframe (ORF) gekloneerd. Onder controle van
dezelfde promoter: één transcript, één (fusie)eiwit. Stopcodon uit eerste gen verwijderd.
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller laralommers. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $7.48. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
52355 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now